表皮葡萄球菌胞外囊泡可规模化生产之路：搅拌罐生物反应器与超滤回收的集成

《International Journal of Molecular Sciences》：Towards a Scalable Production of Staphylococcus epidermidis Extracellular Vesicles: Integration of Stirred-Tank Bioreactor and Ultrafiltration-Based Recovery

　　

革兰氏阳性菌胞外囊泡（EVs）作为疫苗与药物递送的潜在生物技术系统日益受到关注，但可规模化生产规程仍鲜有明确定义。研究人员评估了表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）胞外囊泡受控生产的上游与下游工艺，比较摇瓶培养与受控搅拌罐生物反应器（STBR）下的细菌生长及囊泡释放，并采用超速离心（UC）或超滤（UF）分离囊泡。STBR培养在指数期显著提升生物量积累，同时保持与摇瓶一致的生长期。纳米颗粒示踪分析（NTA）显示两体系均呈时间依赖性颗粒积累，UF回收率始终高于UC。尽管产额不同，两法所得囊泡尺寸分布相近，透射电镜（TEM）确认球形形态。蛋白定量显示UF制备蛋白回收更高，而颗粒-蛋白比表明两法样品组成相似。结果表明，受控STBR发酵联合UF可在不破坏囊泡完整性的前提下实现可重复、可规模化的S. epidermidis EV生产，为革兰氏阳性EV制造提供集成框架，支撑后续转化应用。

研究背景与立项依据

革兰氏阳性菌胞外囊泡（EVs，亦称细胞质膜囊泡CMVs）因厚肽聚糖层曾被认为难以发生囊泡生物发生，相关研究不足二十年，远滞后于革兰氏阴性菌外膜囊泡（OMVs）。现有EV生产多依赖摇瓶培养，其对pH、溶解氧（pO₂）控制有限，氧传递速率（OTR）低，批次间重复性差；下游分离普遍采用超速离心（UC），但UC处理体积小、耗时耗能、高剪切力致囊泡聚集或破损，难以放大。超滤（UF）虽具放大潜力，但革兰氏阳性EV的上下游集成优化尚未系统研究。表皮葡萄球菌EV在炎症皮肤病免疫调节、抗MRSA生物膜及左氧氟沙星纳米载体等场景展现价值，但临床转化需可重复的大体量回收。为此，研究人员在《International Journal of Molecular Sciences》报道了STBR上游培养与UF下游回收的集成方案。

主要关键技术方法

研究以S. epidermidis ATCC 12228为模式菌株，设摇瓶（含/不含预培养）与3 L总体积STBR（工作体积2 L，pO₂ 60%、37℃、125 rpm）两组上游体系；下游对6 h与24 h上清经0.45 μm及0.22 μm微滤后，并行比较死端UF（100 kDa膜、2 bar、100 rpm搅拌）与UC（6000×g预浓集+150000×g 1 h沉淀+洗脱）对同来源样品的回收；表征依托纳米颗粒示踪分析（NTA）计浓度与粒径、BCA法测蛋白、透射电镜（TEM）观形态、颗粒-蛋白比估富集度，以三次独立生物学重复与变异系数（CV）评重复性。

研究结果

2.1 生长曲线与生物量评价

预培养消除4 h滞后期，STBR与摇瓶均直入指数期；6 h时STBR生物量干重1.8 g/L，摇瓶仅0.74 g/L（OD₆₀₀近似），源于STBR均质温控与曝气提升指数期积累；24 h两体系无统计差异。STBR在6 h与24 h生物量CV为14.19%与15.83%，批次变异低。pH由初期7.0升至24 h8.6（摇瓶6.7→8.3），代谢产碱。

2.2 囊泡尺寸与浓度

NTA显示颗粒浓度随时间上升，6 h时STBR-UF与Flask-UF无差异（p=0.9912），24 h微差（p=0.0194）；UF总回收颗粒数显著高于UC，Flask-UC 24 h仅1.73×10¹⁰粒/mL，而STBR-UF达4.56×10¹⁰粒/mL。TSB空白本底5.74×10⁸粒/mL可忽略。粒径模式6 h约136–139 nm，24 h约150–171 nm，TEM证各组合均为完整球形双层膜囊泡，UF未改形。

2.3 蛋白定量

UF各组蛋白浓度无时空差异，Flask-UC显著最低（1436.67 μg/mL）；TSB对照2322.6 μg/mL提示可溶性蛋白未完全剔除，UF总蛋白高系颗粒回收多伴杂蛋白共留。

2.4 EV组成

颗粒-蛋白比在同等发酵时点UF与UC相近，表明UF未额外加重蛋白负荷，可作富集回收替代。

讨论浓缩

STBR+预培养削滞后期，指数期生物量增益归因混匀与pO₂受控，稳定期受营养耗尽限制故无差。UF高产归因于规避UC高g力聚集/破损与小额沉淀损失，但死端UF存膜吸附与污堵，需切向流过滤（TFF）放大。粒径吻合既往S. epidermidis EV 146–172 nm区间，TEM未见结构损，UF稍大粒径或含蛋白聚集体共留。蛋白绝对量非纯度指标，颗粒-蛋白比可比证UF可行。研究为革兰氏阳性EV首例上下游集成评估，未断言全尺度纯化，留待TFF与分子货载（eDNA/eRNA/肽聚糖）表征补全。

结论翻译

综上，本研究证受控STBR培养联合UF回收表皮葡萄球菌EV之可行。STBR于更大工作体积支持培养并在早期生长相获更高生物量，UF在考察条件下较UC获更高颗粒回收。上述发现支持所提流程作为革兰氏阳性菌可重复、可规模化EV生产之有望初步路径。然本研究未确立全工艺放大性，未评EV专属纯度，工程放大参数与全面分子表征尚缺。后续应评尺度依赖参数，聚焦TFF下游及EV身份、纯度、稳定性与生物活性之深析。