《Cancers》：Circulating Tumor DNA in Bladder Cancer: Current Clinical Evidence and Emerging Multi-Omics Perspectives—A Narrative Review
背景：循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA, ctDNA）分析已成为肌层浸润性膀胱癌（muscle-invasive bladder cancer, MIBC）实时疾病监测的一种有前景的工具。本叙述性综述总结了ctDNA在不同疾病阶段当前的临床证据。方法：我们梳理了最新的转化和临床研究结果，纳入了来自改变临床实践试验的关键前瞻性数据，以及关于微小残留病（minimal residual disease, MRD）检测、治疗升级与降级策略以及临床采用中系统性障碍的见解。结果：术后ctDNA阳性持续识别出存在分子残留病（molecular residual disease, MRD）的患者，这些患者的复发和死亡风险显著升高，且通常比影像学复发提前数月出现。前瞻性证据现已验证ctDNA可作为指导辅助免疫治疗升级的预测性生物标志物，而持续ctDNA阴性与较高的长期无病生存率相关。除血浆ctDNA外，新兴的多室液体活检——整合尿液肿瘤DNA（urinary tumor DNA, utDNA）——展现出增强的灵敏度，尤其在保膀胱和局部监测场景中。此外，将基因组ctDNA谱分析与新型转录后层面（如表观转录组学）相结合，为捕捉治疗压力下的肿瘤适应性提供了功能框架。然而，临床转化仍受到检测方法缺乏统一性、分析灵敏度可变以及需要标准化干预阈值的限制。结论：纵向液体活检正迅速将MIBC的管理从静态、基于分期的模式转向动态、分子指导的精准肿瘤学。尽管ctDNA指导的策略显示出强大的临床实用性，但在广泛常规整合之前，仍需前瞻性干预验证和技术标准化。
2. ctDNA作为膀胱癌微小残留病和临床结局的生物标志物
越来越多的证据支持循环肿瘤DNA（ctDNA）在肌层浸润性膀胱癌（MIBC）中既作为预后又作为预测性生物标志物的作用。术后ctDNA阳性持续与显著更高的复发风险和更差的生存结局相关，反映了微小残留病（MRD）的存在。此外，ctDNA有助于识别那些从辅助免疫治疗中获益最大的患者，而ctDNA不可检测的患者通常无论是否接受治疗均获得更有利的结局。重要的是，ctDNA阳性通常比影像学复发提前数月出现，支持其作为分子复发早期标志物的作用。
CheckMate 274试验的探索性长期ctDNA分析进一步表明，ctDNA状态可细化术后风险分层并指导辅助免疫检查点抑制的获益。在该分析中，40.6%的患者在根治性手术后ctDNA可检测，且与较短的无病生存期显著相关（HR 0.30，95% CI 0.18–0.48）。ctDNA阳性患者从辅助纳武利尤单抗治疗中获得的获益大于安慰剂（HR 0.35，95% CI 0.18–0.66），支持ctDNA在治疗选择中的潜在预测作用，尽管仍需前瞻性验证。
TOMBOLA试验进一步证实了肿瘤知情ctDNA监测的临床实用性。该研究中，178名可评估患者接受纵向随访，58%的患者在术后两年内转为ctDNA阳性，ctDNA检测比影像学复发中位提前约90天。
最近，III期IMvigor011试验提供了首个支持ctDNA指导的辅助治疗在肌层浸润性膀胱癌中的前瞻性证据。这项双盲随机研究招募了761名患者，在根治性手术后进行长达1年的系列ctDNA检测；250名ctDNA阳性的患者被随机分配接受阿替利珠单抗或安慰剂。试验显示阿替利珠单抗显著改善无病生存期（HR 0.64；95% CI 0.47–0.87；p = 0.005），中位总生存期为32.8个月对21.1个月（HR 0.59；95% CI 0.39–0.90；p = 0.01）。重要的是，在持续ctDNA阴性的患者中，未接受治疗情况下2年无病生存率为88%，强化了持续ctDNA阴性的强有利预后价值。总体而言，这些发现确立了ctDNA作为一种动态生物标志物，能够基于分子复发而非影像学疾病指导膀胱切除术后治疗决策。探索性分析进一步表明，ctDNA动力学（包括早期清除和定量负荷）可能在二元阳性之外提供额外的预后细化。
ctDNA的预后价值在新辅助治疗中也得到进一步支持。在ABACUS试验中（评估阿替利珠单抗用于不适合或拒绝顺铂的MIBC患者），ctDNA密切反映治疗反应和长期临床结局。ctDNA阳性率从基线时的63%下降至新辅助治疗后的47%，术后进一步降至14%，突出了与治疗反应相关的进行性分子清除。值得注意的是，新辅助治疗后ctDNA阴性的患者中未观察到疾病复发，表明ctDNA清除与持久疾病控制之间存在强关联。
ctDNA阳性的定义和定量解读在不同研究中尚未完全统一。尽管一些定量分析使用了约4.0 MTM/mL的阈值，但该值不应被视为通用的生物学或临床截止值。在几项使用肿瘤知情检测方法的前瞻性MIBC研究中，ctDNA阳性主要根据检测到预定数量的患者特异性肿瘤变异来定义，而MTM/mL作为循环肿瘤负荷及其纵向变化的定量指标。因此，低于4.0 MTM/mL的可检测ctDNA值不应自动解读为临床无关或等同于ctDNA阴性。低水平可检测ctDNA可能代表分子残留病，尤其是在纵向确认或伴随上升趋势时。因此，系列测量和ctDNA变化方向可能比应用单一通用定量阈值更具信息量。
这些发现得到多项在尿路上皮癌人群中接受免疫检查点抑制剂治疗的荟萃分析的支持。在一项九项研究的汇总分析中，基线ctDNA阳性与显著缩短的无病生存期相关。一项更大的荟萃分析证实了这些关联，显示升高的基线ctDNA水平在不同临床背景、检测平台和采样时间点均持续预测更差的无病生存期和总生存期。ctDNA水平下降或清除的患者也获得更有利的结局。
最近的一项系统综述和荟萃分析进一步巩固了ctDNA在根治性膀胱切除术治疗的肌层浸润性膀胱癌中的强大预后价值。在超过1400名患者中，ctDNA阳性与ctDNA阴性状态相比，复发和死亡风险均显著升高。重要的是，尽管辅助免疫治疗似乎在ctDNA阳性患者中带来更大的生存获益，但在ctDNA阴性疾病中的影响有限。
最后，来自转移性尿路上皮癌的转化证据为ctDNA作为治疗反应生物标志物的潜在作用提供了额外见解，尽管其在该场景中的临床效用尚未完全确定。在III期KEYNOTE-361试验的回顾性探索性分析中，基线ctDNA与帕博利珠单抗治疗患者的最佳总体反应、无进展生存期和总生存期显著相关（分别为p = 0.009、p < 0.001和p < 0.001），而在接受化疗的患者中未观察到显著关联。此外，帕博利珠单抗治疗下早期治疗中ctDNA变化与反应和生存结局的关联强于化疗，尽管化疗从基线到早期治疗周期诱导了更大的绝对ctDNA减少。然而，当与影像学反应一起建模时，ctDNA动力学并未显示对总生存期的独立预后价值，表明其增量贡献可能是背景依赖的。这些不同的动力学模式可能反映了细胞毒性化疗和免疫检查点抑制作用机制的基本生物学差异。化疗观察到的明显早期ctDNA减少可能至少部分反映了肿瘤细胞死亡的快速诱导以及由此导致的肿瘤衍生DNA释放到循环中的减少。相反，帕博利珠单抗观察到的较温和的早期ctDNA下降可能与免疫介导肿瘤控制的延迟和异质性有关，其中临床获益依赖于抗肿瘤T细胞反应的激活和扩增，而非直接细胞毒性。
ctDNA动力学与治疗疗效之间的关系也可能受肿瘤潜在生物学特征的影响。特别是，内在或获得性化疗耐药可能导致尽管早期ctDNA减少但持久获益有限，因为化疗可能诱导大量初始肿瘤细胞杀伤而未有效消除耐药亚克隆。相比之下，免疫检查点抑制可能对免疫易感肿瘤克隆施加更具选择性的压力，可能在具有有效抗肿瘤免疫反应的患者中产生较慢但更持久的分子反应。与该假说一致，免疫检查点抑制期间早期ctDNA增加与晚期尿路上皮癌较短的无进展生存期和总生存期相关，而ctDNA减少或清除与持久临床获益相关。
ctDNA与PD-1/PD-L1轴之间的潜在相互作用尤其相关。PD-L1表达是已确立的免疫检查点抑制敏感性生物标志物，尽管并不完美。然而，现有证据不支持将ctDNA水平简单解释为PD-L1表达的替代指标。值得注意的是，在KEYNOTE-361中，帕博利珠单抗组中基线ctDNA或早期ctDNA变化与临床结局之间的关联在调整PD-L1和肿瘤突变负荷后仍然稳健，表明ctDNA可能捕获至少部分与这些常规生物标志物互补的生物学信息。
因此，免疫治疗期间的ctDNA动力学可能代表肿瘤负荷和治疗诱导的进化动力学的复合标志物，而非简单的肿瘤缩小指标。这一解释也可能解释为什么在化疗产生更大绝对ctDNA减少的情况下，ctDNA变化与帕博利珠单抗治疗下的长期结局关联更强。然而，重要的是，这些机制假说仍属探索性，需要通过结合系列ctDNA、肿瘤基因组学、PD-L1表达、免疫谱分析和影像学反应的综合分析进行前瞻性验证。
总体而言，这些发现突出了免疫治疗和化疗之间ctDNA动力学的不同模式，同时也强调了当前在转移性尿路上皮癌中仅依赖ctDNA进行临床决策的局限性。
从诊断和临床效用角度来看，系统性证据表明ctDNA对预测复发和转移进展具有中等准确性。在另一项九项研究的汇总分析中，灵敏度为0.68，特异度为0.76，曲线下面积为0.75，表明具有意义但仍不完全的判别性能。尽管ctDNA反映了实时肿瘤动态并可能增强风险分层，但其独立预测价值仍不足以取代常规影像学和临床评估。因此，当前证据支持其作为辅助工具而非完全独立的决策生物标志物。
3. 肌层浸润性膀胱癌中ctDNA指导的治疗策略
循环肿瘤DNA（ctDNA）在肌层浸润性膀胱癌（MIBC）管理中的临床整合正逐渐将模式从静态、基于分期的决策转向动态、分子指导的治疗策略。除预后相关性外，ctDNA越来越多地被探索作为风险适应性围手术期管理的可操作生物标志物，既能对分子残留病（MRD）患者进行治疗升级，又能对持续ctDNA阴性患者进行潜在降级。在辅助治疗场景中，术后ctDNA阳性持续识别出复发风险显著较高的亚组，通常比影像学复发提前数月，从而定义了有临床意义的早期干预窗口。总体而言，这些数据支持将纵向分子监测作为MIBC术后治疗分配支柱的转变。
在更早期疾病阶段和转移性场景中，ctDNA正作为实时评估治疗反应和治疗敏感性的补充工具出现，尽管其在指导常规临床决策中的作用仍属研究性质。在新辅助治疗背景下，研究发现ctDNA动力学密切反映免疫检查点抑制的病理反应，ctDNA清除与持久疾病控制相关，持续阴性ctDNA识别出结局特别有利、可能最终从治疗降级或保器官策略中获益的患者。在转移性尿路上皮癌中，探索性分析表明ctDNA水平与临床结局相关。然而，在多变量模型中缺乏超越影像学反应的独立预后价值，凸显了当前临床适用性的局限。
4. ctDNA临床实施的障碍
尽管ctDNA在肌层浸润性和转移性尿路上皮癌中具有强大的预后和新兴预测相关性，但其临床转化仍受到若干生物学、技术和方法学障碍的限制。特别是，跨平台的检测方法缺乏统一性——包括肿瘤知情与肿瘤不知情方法、测序深度差异和基因panel设计——引入了检测性能的显著变异性，限制了研究间可比性并阻碍了常规临床采用。此外，缺乏ctDNA阳性的标准化定义和经临床验证的阈值，阻碍了其在治疗算法中的一致性整合，从而限制了其在前瞻性决策框架中的作用。
生物学因素进一步使临床转化复杂化，因为ctDNA释放高度异质，受肿瘤负荷、转移分布、血管分布和治疗暴露的影响。这导致不同疾病阶段的可检测性可变，并增加了假阴性结果的风险，尤其是在低容量或微小残留病场景中。此外，ctDNA动力学尚未完全表征，围手术期、监测和转移性场景中的最佳采样时间表尚未标准化，限制了其作为纵向监测工具在临床工作流程中的可重复性。
从临床整合角度来看，尽管ctDNA与复发风险和治疗反应持续相关，但将其纳入多变量模型时，其相对于既定临床、病理和影像学参数的增量价值仍不一致。在转移性尿路上皮癌中，一旦考虑影像学反应，其独立贡献似乎特别有限，强化了其在不同疾病阶段的背景依赖性能。重要的是，大多数现有证据来自探索性分析或事后评估，而非旨在证明ctDNA指导决策改善结局的前瞻性干预研究。
最后，关键的转化空白仍然存在，包括缺乏验证的干预阈值、纵向监测策略的不确定性，以及支持常规临床实践中广泛实施的健康经济学数据有限。因此，尽管ctDNA代表了疾病监测和风险分层的强大生物标志物，但其当前角色应被视为多模式精准肿瘤学框架中既定临床、病理和影像学决策工具的补充，而非替代。
5. 膀胱癌中的新兴液体活检策略
尿路上皮膀胱癌（UBC）中的新兴证据强调了转化和临床液体活检策略在不同疾病阶段的关键作用。具体而言，肿瘤知情循环肿瘤DNA（ctDNA）和多室检测正在细化风险分层、指导反应适应的保膀胱方法，并通过增强的微小残留病（MRD）检测优化围手术期决策。同时，将肿瘤基因组谱分析与系列ctDNA监测相结合，正成为细化生物学风险分层的策略，可能识别出适合治疗降级或加强监测的候选者。
在HCRN GU 20-444试验中，经TURBT和帕博利珠单抗单药治疗后达到临床定义的完全缓解（cCR）的患者能够安全省略根治性膀胱切除术，同时保持良好结局。此外，治疗后早期ctDNA清除强烈预测改善的无转移生存期和总生存期，验证了ctDNA作为持久疾病控制的稳健早期生物标志物。补充这些发现，RETAIN试验的综合分析证实，治疗后ctDNA阴性显著降低远处转移风险。然而，它对检测单纯膀胱内复发不太敏感，凸显了当前在捕获纯局部残留疾病方面的局限。
超越二元MRD评估，研究现在正在探索根治性膀胱切除术前定量ctDNA阈值的价值。术前ctDNA水平与术后持续阳性相关，有效将患者分为不同的生物学风险组。这表明连续、定量的ctDNA评估可能更好地指导手术决策和围手术期治疗计划。
另一个主要研究焦点是将血浆ctDNA与尿液肿瘤DNA（utDNA）整合到多室液体活检策略中。NIAGARA试验的转化数据表明，围手术期utDNA动力学与无事件生存期和病理反应强烈相关。结合ctDNA和utDNA评估可改善膀胱切除术后残留疾病和肿瘤分期的分层，强调了血浆和尿液在捕获异质性方面的互补价值。这种多模式方法也是CONSOLIDATE I/II期研究的核心，该研究评估恩诺单抗维多汀联合放疗治疗局部晚期肌层浸润性疾病。通过整合配对的ctDNA和utDNA分析，该试验旨在表征MRD动力学并将分子清除与临床结局相关联。
在更早的疾病阶段，特别是原位癌（CIS），前瞻性数据证明了基于血液和尿液的ctDNA分析用于非侵入性监测的可行性。值得注意的是，在该场景中尿液比血浆显示出更高的灵敏度，纵向变化与分子进展和临床结局相关。这确立了尿液来源的ctDNA作为非肌层浸润性疾病高度信息丰富的工具，其中常规监测既有侵入性又受生物学限制。ctDNA与高风险组织学或临床亚组的关系也值得考虑。CIS代表血浆ctDNA检测特别具有挑战性的场景，因为它可能与有限的肿瘤体积和主要为黏膜疾病相关，可能导致较低的全身DNA脱落。因此，CIS患者血浆ctDNA阴性结果不应被解读为不存在残留疾病。在这种情况下，尿液肿瘤DNA可能提供更高的灵敏度，因为它在解剖学上更接近肿瘤室。同样，尿路上皮癌可能表现出分化或混合组织学差异，包括鳞状或腺样分化及其他变异组织学。这些肿瘤可能在基因组景观、肿瘤细胞周转和生物学行为方面有所不同，可能影响ctDNA可检测性以及ctDNA水平与临床结局之间的关系。然而，专门针对MIBC中组织学亚型或混合组织学ctDNA性能的证据仍然有限。未来纳入组织学亚型、基因组特征和纵向ctDNA测量的前瞻性研究，对于确定特定变异组织学是否表现出不同的ctDNA释放或清除模式非常重要。
超灵敏MRD检测的进展进一步由MONSTAR-SCREEN-3项目强调。该研究证明了基于肿瘤知情、全基因组测序的ctDNA检测方法的可行性和广泛基因组覆盖。这些超灵敏平台可以检测低水平ctDNA，追踪术后清除动力学，并可能提前预测影像学复发，强调了个性化检测设计日益增长的重要性。
最后，来自大型电子健康记录（EHR）队列的真实世界证据（RWE）证实了术后ctDNA在常规临床实践中的强大预后价值。术后ctDNA阳性持续与显著更差的总生存期和无病生存期相关，提供超越标准病理完全缓解（pCR）的预后分辨率。值得注意的是，ctDNA识别出非pCR患者中经历特别差结局的高风险亚组，尽管接受了治愈性手术。这强化了液体活检与组织病理学互补的作用，同时强调了在广泛临床实施前进行前瞻性验证的必要性。
6. 未来展望：人工智能与多组学整合
展望未来，ctDNA的临床角色预计将从分子复发的生物标志物演变为治疗适应的动态平台。最近的ctDNA指导试验引入了分子驱动的升级和降级策略概念，其中治疗强度可根据残留疾病的实时评估进行调整，而非仅基于常规临床病理风险因素。未来的发展可能依赖于多个生物学室和分子层面的整合。血浆ctDNA与尿液肿瘤DNA（utDNA）的结合可能改善对全身和局部疾病持续存在的表征，特别是在保膀胱策略和早期复发监测中。此外，将源自ctDNA的基因组信息与功能分子层（包括表观转录组和蛋白质组谱）整合，可能为肿瘤进化、免疫逃逸和治疗耐药机制提供额外见解。
人工智能（AI）和机器学习方法可能代表这些复杂数据集临床转化的关键使能技术。整合纵向ctDNA动力学、影像学、病理学特征和多组学信息的AI驱动算法，可能改善复发风险和治疗反应的个体化预测，超越任何单一生物标志物方法。纳入这些整合框架的前瞻性试验将需要验证其临床效用，建立可重复的干预阈值，并定义其在常规精准肿瘤学工作流程中的角色。
7. 结论
循环肿瘤DNA分析已迅速从纯粹的预后探索工具演变为稳健的动态生物标志物，能够指导肌层浸润性膀胱癌（MIBC）的围手术期和辅助治疗决策。来自改变临床实践试验的前瞻性数据牢固确立了ctDNA指导的免疫治疗升级在分子残留病患者中的临床效用，预示着从静态、基于分期的管理向真正精准肿瘤学的范式转变。然而，完全的临床整合需要克服当前局限，包括检测方法统一性、成本效益分析以及干预阈值的标准化。此外，新兴的多室方法——如血浆ctDNA与尿液肿瘤DNA（utDNA）的整合——以及新型功能层如表观转录组学，有望进一步细化患者分层。最终，纵向液体活检可能成为未来膀胱癌管理的支柱，与常规临床、病理和影像学工作流程完美互补。
