植物乳植杆菌GUANKE及其代谢物苯乳酸减少肠道肺炎克雷伯菌菌群失调及相关肠道炎症损伤

《Microorganisms》：Lactiplantibacillus plantarum GUANKE and Its Metabolite Phenyllactic Acid Reduce Intestinal Klebsiella pneumoniae Dysbacteriosis and Related Gut Inflammatory Injury

　　

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，KP）是一种重要的机会性病原体，可在胃肠道持续存在并作为后续感染的储库。多重耐药KP的日益流行凸显了采用非抗生素策略以限制肠道KP载量及相关宿主损伤的必要性。植物乳植杆菌GUANKE（Lactiplantibacillus plantarum GUANKE，L. plantarum GUANKE）是一种候选益生菌菌株，已有报道表明其具有黏膜屏障保护和炎症调节作用，但其在肠道KP攻击中的作用仍不清楚。本研究通过体外抗菌试验、代谢组学分析、抗生素预处理的肠道KP攻击小鼠模型以及甲型流感病毒（influenza A virus，IAV）/KP肠道共暴露模型，研究了L. plantarum GUANKE及其代谢物苯乳酸（phenyllactic acid，PLA）对KP生长、肠道KP载量及相关炎症损伤的影响。L. plantarum GUANKE及其培养来源产物在体外抑制KP生长。代谢组学分析鉴定PLA为L. plantarum GUANKE发酵上清液中富集的代谢物，外源性PLA以剂量依赖方式直接抑制KP生长。在抗生素预处理的肠道KP攻击小鼠模型中，口服L. plantarum GUANKE降低了肠道KP载量，并与肠道菌群组成改变、盲肠PLA丰度增加、肠道屏障相关参数改善以及炎症反应减轻相关，而外源性PLA部分重现了这些效应。IAV感染增加了肠道KP扩增的易感性，口服L. plantarum GUANKE在IAV/KP肠道共暴露模型中降低了KP载量。在接受多重耐药KP菌株NK04152攻击的小鼠中，L. plantarum GUANKE和PLA降低了肠道KP载量及相关组织损伤，支持其作为抗肠道KP攻击的候选微生物及代谢物策略的潜力。

论文解读：植物乳植杆菌GUANKE及其代谢物苯乳酸对肠道肺炎克雷伯菌感染的保护作用

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，KP）是一种重要的机会性致病菌，可引起肺炎、菌血症、尿路感染和脓毒症等严重医院获得性感染。多重耐药及高毒力菌株的日益流行使KP感染的防治更加复杂。胃肠道是KP的重要储库，肠道定植可成为后续肠外感染和传播的来源。健康宿主中，肠道菌群和黏膜免疫介导的定植抵抗可限制KP扩张；一旦该保护屏障被破坏，KP便可能高丰度持续存在，并诱导肠道炎症损伤。广谱抗生素暴露会降低菌群多样性并耗竭保护性共生菌，从而促进耐药KP扩张。此外，呼吸道病毒感染尤其是甲型流感病毒（influenza A virus，IAV）感染可改变肠道菌群组成和黏膜免疫应答，可能影响继发性细菌并发症的易感性。然而，既往研究多关注继发性呼吸道感染，IAV引起的肠道菌群失调和黏膜免疫紊乱是否会增加经口暴露后肠道KP扩增的易感性，仍缺乏充分探索。益生菌及其代谢物在维持肠道稳态、抑制病原体感染和减轻炎症损伤方面具有重要作用，因此基于菌群和代谢物的干预可能成为抗肠道KP定植及损伤的非抗生素策略。植物乳植杆菌GUANKE（Lactiplantibacillus plantarum GUANKE，L. plantarum GUANKE）分离自健康志愿者粪便，具有黏膜屏障保护、抗病毒免疫和炎症调节等作用，但其在肠道KP感染中的作用尚不清楚。苯乳酸（phenyllactic acid，PLA）是乳酸菌等产生的芳香族有机酸，具有抗菌、抗炎和抗病毒活性，且已有体外研究显示PLA可拮抗KP生长。基于此，研究人员探究了L. plantarum GUANKE及其代谢物PLA在体内外对KP的抑制作用及对肠道损伤的保护效应。

研究人员利用体外共培养及发酵上清液抗菌试验、代谢组学分析和靶向有机酸定量技术，并构建了抗生素预处理的肠道KP攻击小鼠模型和IAV/KP肠道共暴露模型。小鼠为SPF级雌性C57BL/6J小鼠（购自北京维通利华实验动物技术有限公司），KP菌株NK04152由中国科学院微生物研究所冯杰博士提供。通过16S rRNA基因测序分析肠道菌群，利用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测结肠和肠系膜淋巴结中细胞因子及紧密连接分子表达，采用Western blot检测Occludin和Claudin-1蛋白水平，通过ELISA检测肺组织IL-1β和TNF-α浓度，并采用TCID50法测定肺病毒滴度。

研究结果如下。3.1 L. plantarum GUANKE和PLA在体外表现出抑制KP生长的活性。通过共培养试验发现，L. plantarum GUANKE以时间和比例依赖方式抑制KP生长；其无细胞发酵上清液经热灭活后仍保留抑制活性，而pH中和后活性显著减弱，表明酸度和热稳定胞外因子共同参与抑制。未靶向代谢组学显示PLA在L. plantarum GUANKE发酵上清液中富集，且与KP活菌数呈最强负相关。外源性PLA以剂量依赖方式直接抑制KP生长，浓度≥0.7 mg/mL时几乎完全抑制。3.2 L. plantarum GUANKE和PLA在体内降低肠道KP载量。在抗生素预处理的小鼠模型中，KP攻击后口服L. plantarum GUANKE从第3天起显著降低粪便KP载量，并伴随肠道菌群多样性和结构改变、盲肠PLA丰度升高；外源性PLA从第5天起也显著降低粪便KP载量。选择性培养未在肠外器官或血液中检出KP，表明未见可检测的细菌易位。3.3 L. plantarum GUANKE和PLA减轻KP相关的肠道屏障损伤和炎症。KP攻击导致结肠长度缩短、紧密连接分子ZO-1、Occludin和Claudin-1表达降低，同时结肠和肠系膜淋巴结中TNF-α、IL-6和IL-18水平升高；L. plantarum GUANKE干预可部分逆转这些变化。外源性PLA部分重现了保护效应，包括恢复结肠长度、上调Occludin表达并降低IL-18水平。3.4 流感增强宿主对肠道KP攻击的易感性，并加重流感相关肺炎。在未经抗生素预处理的小鼠中，单纯KP攻击仅产生低水平粪便KP；IAV感染后粪便KP显著增加，且攻毒时间在感染后第5天高于第3天。IAV与KP共暴露进一步增加肺指数和肺组织IL-1β、TNF-α浓度，但不改变PR8 M1表达和肺病毒滴度，同时加重肺组织病理损伤。16S rRNA测序显示IAV感染是驱动菌群失调的主要因素，IAV/KP共暴露进一步改变菌群结构并升高菌群失调指数。3.5 L. plantarum GUANKE在IAV/KP共暴露小鼠中降低肠道KP载量并减轻肺部炎症。在IAV+KP肠道共暴露模型中，口服L. plantarum GUANKE显著降低粪便KP载量，同时降低肺指数和肺组织IL-1β、TNF-α水平。

讨论部分指出，L. plantarum GUANKE的抗KP活性与发酵液酸度密切相关，PLA是贡献性代谢物之一，但并非唯一介导因素。发酵上清液中PLA浓度约为0.2 mg/mL，低于纯品PLA发挥显著抑制作用所需的0.7 mg/mL，且向MRS培养基补充0.2 mg/mL纯PLA并不能显著抑制KP，提示天然发酵上清液中的PLA可能以不同形式存在，或与其它有机酸和代谢物协同发挥作用。L. plantarum GUANKE通过降低肠道菌群失调、维护肠道屏障完整性和抑制炎症反应，发挥多层次保护作用。IAV感染可能通过破坏菌群和黏膜稳态，形成有利于KP扩增的肠道环境。研究局限性包括仅使用一株多重耐药KP菌株NK04152，且未进行PLA缺失和回补实验。研究结论为：在KP菌株NK04152攻击的小鼠模型中，L. plantarum GUANKE和PLA减少了肠道KP载量，减轻了肠道屏障破坏和炎症损伤。