《Microorganisms》：Bacterial Communities Associated with Deschampsia antarctica in Chronically Diesel-Contaminated Soils: Candidate Taxa for Microbe-Assisted Phytoremediation
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摘要
南极洲超过六十多年的人类活动导致研究站周围土壤长期受到柴油污染。利用南极本土维管植物南极发草（Deschampsia antarctica）进行植物修复（phytoremediation），是少数符合《南极条约体系》准则的修复策略之一。获取合适的根际微
摘要
南极洲超过六十多年的人类活动导致研究站周围土壤长期受到柴油污染。利用南极本土维管植物南极发草（Deschampsia antarctica）进行植物修复（phytoremediation），是少数符合《南极条约体系》准则的修复策略之一。获取合适的根际微生物资源是该策略的核心。本研究结合免培养的16S rRNA基因扩增子测序（16S rRNA gene amplicon sequencing）、PICRUSt2功能预测（functional prediction）以及依赖培养的细菌菌株分离方法，对生长在卡利尼站（Carlini Station）长期柴油污染土壤以及南设得兰群岛（South Shetland Islands）25 de Mayo（乔治王岛）三个原始生境中的南极发草根际（rhizosphere）和根内生（root endosphere）细菌群落进行了表征。根际微生物群落的一致性多样性始终高于根内生群落，且前者受采样点和相关土壤理化变量的影响更为强烈，其中污染位点的群落组成最为独特，而根内生群落相对稳定并受到宿主选择的影响。与长期污染位点相关的群落表现出显著的组成差异，且根际中预测的烃降解途径丰度更高。Polaromonas、Rhodococcus、Mycobacterium和Devosia在分类学、生物标志物和预测功能分析中反复与污染位点的群落相关联。其中Polaromonas、Rhodococcus和Devosia属的成员也通过培养方法获得。这些类群代表了未来在南极洲开发微生物辅助植物修复策略的合适候选菌。
**论文解读：长期柴油污染背景下南极发草根际与内生细菌群落的生态特征及修复候选类群**
**1. 研究背景与科学问题**
南极洲超过六十年的科研与后勤活动，尤其是研究站周边冰-free海岸区域，造成了显著的环境遗留问题。石油烃（主要为南极混合柴油，Antarctic Blend Diesel, ABD）作为多数考察站的主要能源，其运输、储存和使用过程中的泄漏导致站区附近土壤长期受到污染。由于考察站地理位置偏远、后勤成本高昂、极端天气条件以及南极治理体系的环境议定书限制，实施清理活动面临巨大挑战。因此，应用符合国际南极社会认可的环境友好型修复方法至关重要。生物修复（bioremediation），特别是利用具烃降解能力的植物促生细菌（hydrocarbonoclastic plant-growth promoting bacteria）辅助的植物修复（microbe-assisted phytoremediation），成为一种有前景且符合议定书的策略。然而，《南极条约》及其《环境保护议定书》禁止引入外来生物，这限制植物修复策略只能使用两种本土维管植物，其中南极发草（*Deschampsia antarctica*）已被证明在田间条件下能耐受高达40,000 mg·kg?1的柴油浓度而不出现50%的生物量或叶绿素含量减少。获取植物根际独特的嗜冷微生物资源是该策略的核心，因为仅靠植物本身难以实现完全的烃类去除。当前微生物组研究存在自上而下（免培养）与自下而上（依赖培养）两种范式，二者各具优缺点，整合二者（如测序引导的定向培养）是被普遍认可的路径。因此，深入理解慢性烃污染下南极发草根际微生物组的生态学特性，是开发基于可靠信息、有效且稳健的植物修复方法的前提。本研究旨在回答以下科学问题：(i) 污染土壤中植物根际相关微生物组是否与原始生境存在差异？(ii) 根际与根内生是否拥有不同且互补的微生物集合？(iii) 能否分离获得可培养的、具烃降解潜力的菌株，以用于设计有效的修复工具？
**2. 主要技术方法与研究设计**
为回答上述问题，研究人员于2019–2020年南极夏季，在南极南设得兰群岛25 de Mayo（乔治王岛）卡利尼站附近选取四个生境：两个南极特别保护区（ASPA1、ASPA2）、一个非保护区非污染位点（Hill）及一个长期暴露于ABD和润滑油超过三十年的污染位点。共采集15株南极发草个体，分别获取根际土壤和根组织（即根内生）样品共30份。研究人员采用了以下关键技术方法：1) 通过基于DADA2流程的16S rRNA基因V3–V4区扩增子测序（Illumina MiSeq平台）进行免培养的群落组成分析；2) 运用PICRUSt2工具基于核心微生物组（core microbiome，即在各组≥50%样品中存在的ASVs）预测其功能潜能（KEGG直系同源组，KOs）；3) 使用LEfSe（线性判别分析效应量）进行差异丰度分析以识别特定生境相关的生物标志类群；4) 于2020–2021年南极夏季在污染位点进行依赖培养的细菌分离，通过全长16S rRNA基因纳米孔测序（Oxford Nanopore MinION）鉴定菌株。此外，还测定了土壤理化性质（TOC、OM、P、质地）和总石油烃（TPH）浓度。
**3. 主要研究结果**
**3.1 Alpha和Beta多样性**：根际细菌群落的多样性（Shannon指数和ASV丰富度）始终高于根内生群落。根际群落的组成受采样点显著影响，PERMANOVA分析显示采样点可解释64.5%的群落变异（R2 = 0.645，p = 0.001），且与土壤总有机碳（TOC）、有机质（OM）、磷和黏粒含量显著相关。相比之下，根内生群落组成在不同采样点间相对稳定，采样点仅解释24.4%的变异（R2 = 0.244，p = 0.139），且与测量的土壤理化变量无显著关联。污染位点的根际群落在排序图上沿主坐标轴与原始位点明显分离，而α多样性并无显著增减，表明慢性污染主要引起群落组成的更替而非多样性的丧失。
**3.2 细菌群落的分类学组成**：在门水平，放线菌门（Actinomycetota，根际37.1%/内生32.6%）和假单胞菌门（Pseudomonadota，根际19.4%/内生50.3%）主导所有群落。污染位点的根际和内生群落中，假单胞菌门的相对丰度均升高（根际26.9%，内生59.9%）。在科水平，污染位点根际富集了丛毛单胞菌科（Comamonadaceae）、分枝杆菌科（Mycobacteriaceae）、小单孢菌科（Gemmataceae）、诺卡氏菌科（Nocardiaceae）和Devosiaceae。根内生群落结构则高度保守，微杆菌科（Microbacteriaceae）和草酸杆菌科（Oxalobacteraceae）是跨位点的主要优势科，但污染位点的内生群落中，希万氏菌科（Shewanellaceae）、黄杆菌科（Flavobacteriaceae）、Devosiaceae和Nakamurellaceae的相对丰度增加。
**3.3 差异丰度类群（LEfSe）**：LEfSe分析揭示了与污染位点和原始位点显著关联的不同属。*Polaromonas*、*Rhodococcus*和*Williamsia*在根际和根内生中均被鉴定为污染位点的生物标志物。此外，污染位点根际还富集了*Mycobacterium*、*Gemmata*、*Fimbriiglobus*、*Rhizobacter*、*Devosia*、*Cellulomonas*和*Bradyrhizobium*，而原始位点根际则以*Nakamurella*、*Tundrisphaera*、*Janibacter*和*Conexibacter*为特征。污染位点内生群落的差异属还包括*Legionella*、*Aeromicrobium*、*Candidatus Ovatusbacter*、*Rhodoglobus*、*Lysobacter*和*Opitutus*。
**3.4 核心微生物组的预测功能谱**：PICRUSt2预测了核心微生物组的5845个KOs。污染位点的根际群落显示出最高的苯甲酸盐、萘、多环芳烃（PAHs）、氯环己烷、氯苯和氯烷烃降解途径的预测丰度，同时脂肪酸降解和铁载体产生途径也显著富集。相比之下，污染位点根内生群落并未表现出烃降解途径的显著增加。原始位点中，ASPA2富集了与细胞生长和中枢代谢相关的途径，而Hill位点的根际和内生均显示出相对较高的芳香族化合物和PAH降解途径预测丰度，尽管该位点TPH浓度低于检测限。
**3.5 烃降解基因的预测属水平贡献者**：通过分析特定KOs，研究人员发现根际群落中有85个KOs的预测丰度在污染位点与原始位点间存在显著差异（FDR < 0.05）。与烷烃降解相关的基因（如*alkB*、*alkT*、*ACADL*）主要预测贡献来自*Mycobacterium*和*Rhodococcus*；与PAH降解相关的基因（*nahAa*、*nahAb*）主要贡献来自*Polaromonas*（36.4%）；与芳香族化合物降解相关的*ligA*/*ligB*主要贡献来自*Novosphingobium*和*Sphingomonas*，而*mhpE*的贡献则主要来自*Mycobacterium*和*Rhodococcus*；与卤代化合物降解相关的基因（*dehH*、*dhaA*）贡献分布较广，包括*Mycobacterium*、*Polaromonas*、*Rhizobacter*、*Bradyrhizobium*和*Devosia*。值得注意的是，多个降解基因的预测贡献中有近一半或更多归属于未分类类群，提示还存在未被描述的烃降解微生物。
**3.6 微生物辅助植物修复的候选类群**：综合培养无关和培养依赖的分析结果，*Polaromonas*、*Rhodococcus*和*Devosia*因满足三项互补标准而被确定为最强的候选类群：(i) 在污染位点根际的免培养分析中被显著突出；(ii) 在随后的野外采样中成功分离获得（共获得187株代表38个属的细菌分离株）；(iii) 先前研究已报道它们具备烃降解或适应寒冷污染环境的相关特性。*Mycobacterium*虽然在免培养分析中同样与污染位点显著关联，但在本次培养收集中未获得分离株。
**4. 结论与展望**
本研究首次结合免培养和依赖培养的方法，对长期柴油污染和原始南极土壤中南极发草相关细菌群落进行了生态学表征。研究揭示了根际和根内生作为互补的生态位：根际群落受环境因素（如土壤性质、污染）强烈影响，是多样且可能特化的烃降解微生物的储库，并预测具有更高的烃降解途径丰度；而根内生群落受宿主选择主导，结构稳定，可能含有与植物适应性和抗逆性相关的功能类群。综合分类学、生物标志物和预测功能分析，研究突出显示了*Polaromonas*、*Rhodococcus*、*Mycobacterium*和*Devosia*作为污染位点根际相关的重要类群，其中前三种属的成功分离进一步支持了它们作为测序引导培养和未来实验表征的优先目标。这些冷适应型属的鉴定及其可培养代表的获得，为开发适用于南极环境的整合型微生物辅助植物修复策略迈出了至关重要的第一步。该研究论文发表于《Microorganisms》。
