果蝇求偶行为中由双突触示踪工具ds-Tango揭示的汇聚性嗅觉回路

《Current Biology》：Convergent olfactory circuits for courtship in Drosophila revealed by the circuit-tracing tool ds-Tango

　　

动物表现出由性别二态性回路调控的性别特异性行为。雄性黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）的求偶行为作为一种此类行为，受包括嗅觉在内的多种感觉模态调节。本研究揭示了雄性果蝇中性别二态性嗅觉通路如何汇聚到外侧角（lateral horn, LH）输出神经元（即嗅觉回路中的第三级神经元）以调控求偶。为此，研究人员开发了ds-Tango，一种改良自单突触示踪与操控工具trans-Tango的新工具。在ds-Tango中，两套不同的trans-Tango构型串联排布，从而选择性遗传访问起始神经元（starter neurons）的单突触伙伴及其双突触连接。利用ds-Tango，研究人员鉴定出一个三种性别二态性嗅觉通路的汇聚节点。沉默该节点导致雄性间求偶行为，除非有雌性在场。因此，研究结果确定了对外侧角输出神经元中对正常求偶行为重要的群体，并确立ds-Tango作为双突触回路示踪的工具。

研究背景与立项依据：黑腹果蝇雄性交配求偶受视觉、听觉、触觉、味觉和嗅觉共同调控，其中挥发性信息素与食物气味等嗅觉线索通过性别二态性通路影响行为。已有研究指出Or47b、Or67d与Ir84a三类携带雄性特异转录因子Fruitless（Fru^M）与Doublesex（Dsx^M）的嗅觉感觉神经元（olfactory sensory neurons, OSNs）分别检测不同求偶相关气味，其下游投射神经元（olfactory projection neurons, OPNs）均投向外侧角腹侧，但外侧角内如何整合这三路信号并转化为适宜求偶输出仍属未知。鉴于外侧角为先天行为整合枢纽，研究人员旨在定位外侧角内接收三路Fru^M+嗅觉输入的共同第三级节点，并解析其功能。

论文发表于《Current Biology》。研究人员通过开展前述问题驱动的研究，得出三路性别二态嗅觉通路汇聚于外侧角一类第三级输出神经元（命名为Maiandros神经元，即LHAV2b2a/b亚群），沉默该节点导致雄性对雄性异常求偶但雌性在场时受抑，确立了ds-Tango这一双突触遗传示踪新工具。

主要关键技术方法（不超250字）：研究以黑腹果蝇为模型，构建并验证串联双trans-Tango系统的ds-Tango（含Gal4/UAS启动GCG::dNRXN1、跨突触激活GCGR::TEVcs::LexA释放LexA驱动PTH::dNRXN1、再跨突触激活PTHR::TEVcs::QF释放QF的三层报告架构），结合fru-FLP交集遗传限制于Fru^M+神经元；利用Or67d-Gal4、Or47b-Gal4、Ir84a-Gal4、Orco-Gal4等驱动示踪；以Flywire与雄性中枢神经连接组（connectome）模拟并校验突触权重阈值；采用LH2088-Gal4结合突触标记（Synaptotagmin::GFP、DenMark）定极性；用温度敏感型Shibire^ts在31℃阻断Maiandros神经元传导，以单侧翅伸展为求偶指标行两两及三雄雌行为学定量。

研究结果：

第二级神经元在性别二态嗅觉通路中投射至腹侧外侧角。研究人员用trans-Tango从Or67d、Or47b、Ir84a三类OSNs示踪，发现其OPNs分别严格投向外侧角腹侧或兼顾背侧，提示腹侧外侧角为三路潜在汇聚区，由此推进至第三级绘图。

ds-Tango的设计。研究人员将两套trans-Tango级联，第一级GCG配体在起始神经元表达并跨突触释放LexA*于单突触伙伴，后者表达PTH配体再跨突触释放QF于双突触连接，实现起始、单突触（绿）、双突触（紫核）三层分色访问，并在无Gal4对照中确认背景极低。

ds-Tango在嗅觉系统中差异标记第二、三级神经元。以Orco-Gal4启动，研究人员计数中枢脑内单突触约257、双突触约1402真阳性，对照连接组模拟确定单突触突触权阈≈212、双突触≈87；缺失PTH配体构型不标第三级，证明PTH依赖性；温度与日龄被证为信号量效变量，21℃与羽化后3–4周为推荐条件。

ds-Tango的特异性。从Or67d（信息素）与Or42a（食物气味）分别启动，研究人员观察到外侧角腹侧vs背侧靶向差异及LH/MB周围第三级比例迥异（Or67d约14:1，Or42a约2:1），证实电路特异性。

ds-Tango揭示Or67d通路中外侧角的性别二态。结合fru-FLP交集标记，研究人员发现腹侧外侧角LC1/LC2两性皆有，而背侧DC1/DC2仅雄性接收Or67d-OPN输入，与连接组LC1雄100雌54、LC2两性约60一致，确证工具可分辨性别二态。

求偶调控嗅觉通路的汇聚节点。研究人员对Or47b与Ir84a启动ds-Tango+fru-FLP限制，比较三路（含前述Or67d）第三级，锁定均投向外侧角腹侧并下延至前腹外侧原脑（anterior ventrolateral protocerebrum, AVLP）的Maiandros神经元（LHAV2b2a/b），连接组复核其为三路共有第三级。

Maiandros神经元活性是抑制雄雄求偶所必需。LH2088-Gal4示其雄性树突更背、轴突更腹，约70%输入来自嗅觉（13%源自性别二态嗅小球：VA1v 45%、VL2a 37%、DA1 18%），VA1v多抑制（87%）、VL2a/DA1多兴奋（77%/69%），神经元本身仅胆碱能（ChAT+，GABA-）。Shibire^ts在31℃沉默后，雄-雄配对翅伸展时间与次数极显著升高（p<0.001），无目标时不自发起舞。

沉默Maiandros神经元在有雌性时不引发雄雄求偶。研究人员设雄-雌配对及雄-雌-雄三体竞争，发现31℃沉默组仍只追雌不追雄，表明并非全面亢奋或性别识别丧失，而是上下文依赖地解除对雄体求偶之抑制。

讨论与结论翻译：先天求偶行为需硬连线回路整合多模态线索。研究人员开发ds-Tango，示踪三路Fru^M+ OSN的双突触下游，发现Maiandros（LHAV2b2a/b）为外侧角汇聚第三级，经AVLP传递；沉默之致雄雄求偶但不扰雄雌求偶，说明其求和兴奋/抑制输入（Or47b抑、Ir84a兴、Or67d弱兴）而抑制向雄求偶。ds-Tango首供三层选择性访问，补强连接组之群体/性别/环境可比性局限。该节点结构或可推广至食物趋避等其他外侧角通路，为理解脑控先天行为递进一环。