双酚诱导斑马鱼嗅觉毒性的分子机制解析

《Toxics》：Unveiling the Molecular Mechanisms of Bisphenol-Induced Olfactory Toxicity in Zebrafish

　　

双酚类似物，包括双酚F（BPF）和双酚S（BPS），正日益作为双酚A（BPA）的替代品被使用，然而它们潜在的嗅觉效应仍知之甚少。在本研究中，成年斑马鱼（Danio rerio）暴露于环境相关浓度（5 μg/L）的BPF和BPS中28天，以探究其对嗅觉系统的影响。组织病理学评估揭示了嗅觉上皮形态的改变，尤其在BPF暴露组中。转录组分析在BPF和BPS暴露组中分别鉴定出3260和1602个差异表达基因，涉及信号转导、免疫应答、内分泌调节、细胞凋亡和嗅觉信号传导等相关通路。进一步的分子对接和200 ns分子动力学模拟表明，BPF与靶蛋白（OR、GNB2和p53）之间表现出更强的结合亲和力和更多的疏水接触，相互作用稳定。结合自由能计算证实了BPF具有更大的结合潜力。这些发现表明，BPF可能比BPS发挥更强的嗅觉毒性，破坏水生生物的信号传递和感觉功能。本研究为双酚诱导嗅觉破坏的分子基础提供了新的机制见解，并强调了BPF和BPS在水生环境中的生态风险。

**论文解读：双酚诱导斑马鱼嗅觉毒性的分子机制研究**

**一、研究背景与科学问题**

双酚类似物（bisphenol analogues）作为环氧树脂和聚碳酸酯塑料生产中的改性剂、稳定剂和光引发剂，在工业生产中扮演着重要角色。双酚A（bisphenol A, BPA）的年产量约为1000万吨，而其主要替代品双酚S（bisphenol S, BPS）和双酚F（bisphenol F, BPF）的年产量分别约为10万吨和1万吨。随着全球多个司法管辖区实施逐步淘汰BPA的法规，BPF和BPS的使用量显著增加。这些化合物通过生产过程排放、污水处理厂不完全去除、垃圾填埋场渗滤以及含BPF和BPS材料降解等途径广泛存在于水生生态系统中。环境监测数据显示，孟加拉国图拉格河中BPF浓度范围为1.12至7.31 μg/L，印度阿德亚尔河中BPS最大检出浓度为7.20 μg/L。BPF在地表水中的半衰期约为44.0天，BPS在自然水生条件下表现出显著的持久性和极低的降解率。由于环境稳定性和广泛分布性，双酚类化合物具有在水生生物体内生物累积的潜力。研究已在长江流域26.2%和50.8%的野生鱼类样本中分别检出BPF和BPS，在珠江口20个物种中的平均浓度分别为30.9和50.6 ng/g。

BPF和BPS已被鉴定为神经内分泌干扰化学物（neuroendocrine-disrupting chemicals），具有生殖和神经毒性效应。已有研究表明，BPF可激活斑马鱼小胶质细胞、诱导炎症并导致神经元细胞丢失。嗅觉系统是神经系统的重要组成部分，在感觉处理中发挥基础性作用，使鱼类能够在大范围和远距离内检测和识别水中的微量物质，对觅食、繁殖和捕食者规避等行为至关重要。然而，关于双酚类等神经内分泌干扰物对鱼类嗅觉系统影响的研究仍然有限。环境污染物暴露已被证实可损害嗅觉系统，例如二硫代氨基甲酸盐可减少嗅觉感觉神经元数量和cAMP活性，甲基对硫磷可降低乙酰胆碱酯酶水平并抑制嗅觉系统中的谷氨酸能神经传递，乙炔雌二醇可激活嗅球中雌激素反应细胞并抑制嗅觉介导的神经元活性。然而，双酚类化合物是否对鱼类嗅觉系统产生毒性效应及其具体分子机制尚不清楚。

**二、研究内容与主要技术方法**

本研究采用多学科交叉的研究框架，通过组织病理学评估、转录组分析、分子对接和分子动力学模拟等先进技术手段，系统探究BPF和BPS对斑马鱼嗅觉系统的毒性效应及其分子机制。研究人员将成年斑马鱼暴露于环境相关浓度（5 μg/L）的BPF和BPS中28天，并设置空白对照组。主要关键技术方法包括：（1）组织病理学分析：采用苏木精-伊红（H&E）染色结合形态计量学定量分析，评估嗅觉上皮形态变化；（2）转录组测序：利用Illumina NovaSeq 6000平台进行RNA测序，通过DESeq2软件鉴定差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs），并利用基因本体论（Gene Ontology, GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）通路富集分析注释基因功能；（3）分子对接：使用AutoDock Vina软件预测BPF/BPS与靶蛋白的结合亲和力，靶蛋白基于转录组显著富集通路中的关键基因选定；（4）分子动力学（molecular dynamics, MD）模拟：使用GROMACS 2023.2软件进行200 ns模拟，评估蛋白质-配体复合物的结构稳定性和相互作用机制，并通过分子力学/泊松-玻尔兹曼表面积（MM-PBSA）方法计算结合自由能。所有实验程序经上海技术大学机构动物护理和使用委员会批准（SIT-2025-LL44）。

**三、主要研究结果**

**3.1 BPF和BPS对斑马鱼嗅觉组织病理学的影响**

组织病理学分析和形态计量学定量结果显示，28天暴露后，斑马鱼嗅觉上皮（olfactory epithelium, OE）出现轻微改变，尤其是在BPF暴露组。对照组OE保持正常结构，各层细胞排列整齐，无明显病变。BPF和BPS暴露组嗅觉片出现轻微变化，包括上皮增厚和片层增宽。定量分析显示，BPF组上皮厚度从对照组的4.4 μm增加至7.9 μm，片层宽度从50.9 μm增加至72.1 μm。BPS组变化轻微，上皮厚度为4.9 μm，片层宽度为47.9 μm，与对照组相比无显著差异。结果表明，在本实验条件下，BPF暴露比BPS暴露对斑马鱼嗅觉上皮诱导更多改变，观察到受体细胞肿胀。

**3.2 斑马鱼嗅觉转录组谱的影响**

转录组分析显示，PCA分析中PC1和PC2分别解释了总方差的34.78%和30.05%，合计64.83%。差异基因表达分析鉴定出BPF与对照组间3260个DEGs（2207个上调，1053个下调），BPS与对照组间1602个DEGs（713个上调，889个下调）。维恩分析显示，BPF和BPS处理间共享488个DEGs，BPF和BPS特异性DEGs分别为2772个和1114个。KEGG富集分析确定前5个显著受影响通路：同源重组、嘧啶代谢、糖胺聚糖生物合成（硫酸乙酰肝素/肝素）、p53信号通路和DNA复制。这些改变的通路并非独立事件，而可能通过机制性连接，因为嗅觉上皮作为感觉神经组织，内分泌相关信号传导和细胞内信号转导的干扰可能影响气味识别、神经元通讯、上皮稳态和细胞应激反应。

**3.3 分子对接分析**

基于KEGG功能注释和富集分析，从靶通路中选出11个靶蛋白进行分子对接分析，包括信号相关通路中的PDE（磷酸二酯酶）、CAMK2D2（钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II delta 2）、NeuroD（神经源性分化因子）、GNB2（G蛋白β2亚基）、GNG7（鸟嘌呤核苷酸结合蛋白γ7亚基）和OR（嗅觉受体）；细胞生长与死亡通路中的CDK1（细胞周期蛋白依赖性激酶1）、CCNB3（G2/有丝分裂特异性细胞周期蛋白-B3）和p53（细胞肿瘤抗原p53）；免疫系统通路中的FOSL1（FOS样1，AP-1转录因子亚基β）；内分泌系统通路中的CREB1（环磷酸腺苷反应元件结合蛋白1b）。对接结果显示，除BPF与CDK1（?4.6 kcal/mol）和BPS与CDK1（?4.7 kcal/mol）外，结合能（Eb）值介于?5.1至?8.3 kcal/mol之间。BPF（45个疏水键和16个氢键）比BPS（33个疏水键和12个氢键）与受体残基形成更多键，表明BPF可能具有更广泛和稳定的结合界面。

**3.4 分子动力学模拟**

对11个蛋白质-BPF/BPS复合物进行200 ns MD模拟。其中OR、GNB2和p53复合物表现出相对稳定的构象行为，被选为代表复合物进行详细轨迹可视化和关键帧分析。三个代表性复合物的均方根偏差（RMSD）值保持在0.5 nm以下，回旋半径（Rgyr）值稳定在约1.5-2.3 nm，均方根波动（RMSF）值低于0.5 nm，表明复合物整体结构稳定性良好。关键帧结构比对显示，OR系统中BPF在200 ns时保留更少但更一致的疏水接触（主要与LEU、ILE、VAL、TYR），表明结合口袋明确且持久；BPS维持较少的疏水相互作用但与带电残基（ARG、GLY、LYS）形成更多氢键，表明依赖极性稳定化。MM-PBSA结合自由能计算显示，OR-BPF系统结合自由能（ΔGBinding = ?31.72 kcal/mol）显著优于OR-BPS（?20.51 kcal/mol），主要由更有利的范德华相互作用驱动。GNB2和p53系统的ΔGBinding值在BPF和BPS间相当。能量分解分析表明，BPF通常比BPS表现出更强的结合相互作用，这一差异主要归因于更有利的范德华贡献。

**四、讨论与结论**

本研究表明，环境相关浓度的BPF和BPS暴露可通过分子变化诱导斑马鱼嗅觉组织微妙的细胞改变。组织病理学分析揭示了上皮厚度和片层宽度的变化，转录组、分子对接和分子动力学模拟提供了BPF/BPS与OR、GNB2和p53之间存在潜在相互作用的计算证据，可能影响信号转导、内分泌调节、免疫应答和细胞存活通路。结合自由能计算表明BPF可能比BPS表现出更强的相互作用。这些发现强调，即使没有明显的组织损伤，BPF和BPS也可能扰乱嗅觉分子通路。值得注意的是，分子对接和MD模拟的预测基于AlphaFold生成的结构，因此需要进一步的实验验证。未来研究应使用配体结合测定、受体活性测定或其他生化方法验证这些预测的蛋白质-配体相互作用及其功能后果。此外，电子显微镜可用于检查嗅觉片层的精细超微结构变化，细胞类型特异性标记物有助于鉴定p53反应细胞群，进一步研究可评估对水生生物嗅觉功能的潜在性别特异性效应。该研究为双酚诱导嗅觉破坏的分子基础提供了新的机制见解，强调了BPF和BPS在水生环境中的生态风险。