《Current Biology》：Co-option of a conserved lateral-root development program by symbiotic signals
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Nod因子（NFs）是微生物信号，最初因其在豆科植物固氮根瘤共生中的关键作用而被鉴定。除共生功能外，NFs还具有跨不同植物物种（包括非豆科植物）诱导侧根形成的保守能力。目前已明确，根瘤器官发生程序共选（co-opt）了多个参与根系发育的分子机制，这引出了一
Nod因子（NFs）是微生物信号，最初因其在豆科植物固氮根瘤共生中的关键作用而被鉴定。除共生功能外，NFs还具有跨不同植物物种（包括非豆科植物）诱导侧根形成的保守能力。目前已明确，根瘤器官发生程序共选（co-opt）了多个参与根系发育的分子机制，这引出了一个问题：NFs通过何种发育途径触发侧根形成，以及该途径在豆科植物中与根瘤器官发生的重叠程度。在蒺藜苜蓿（*Medicago truncatula*）中，NF对侧根形成的刺激作用独立于细胞分裂素受体CYTOKININ RESPONSE 1（CRE1），后者是侧根形成的负调控因子。本研究表明，这种刺激作用同样独立于NODULE INCEPTION（NIN）转录因子——一个在细胞分裂素感知下游发挥作用的根瘤器官发生主要调控因子。相反，NFs通过影响生长素（auxin）生物合成并调节生长素信号来刺激侧根形成，特别是在蒺藜苜蓿中通过Auxin/INDOLE-3-ACETIC ACID 7（Aux/IAA7）起作用。利用反向遗传学和跨物种互补实验，研究人员证明*MtIAA7*的直系同源基因——拟南芥（*Arabidopsis thaliana*）中的*AtIAA29*和番茄（*Solanum lycopersicum*）中的*SlIAA29*——在侧根形成中具有保守功能。MtIAA7还能与AUXIN RESPONSE FACTOR（ARF）的直系同源蛋白（对应于*AtARF7*和*AtARF19*，已知控制拟南芥侧根形成）相互作用。综上所述，研究结果揭示了在蒺藜苜蓿中，NFs通过一个保守的生长素信号模块，控制一条真正的侧根形成途径，该途径独立于根瘤器官发生途径。
## 论文解读
### 研究背景与科学问题
豆科植物能与固氮根瘤菌建立内共生关系，从而在贫氮环境中生存。在这一共生过程起始阶段，根瘤菌产生脂质几丁寡糖（lipo-chitooligosaccharide, LCO）信号，即Nod因子（Nod factors, NFs），最初被鉴定为建立根瘤共生所必需。NFs作为分子签名决定宿主特异性，触发根表皮中的早期共生反应，包括钙振荡和根毛变形。值得注意的是，纯化的NFs在无微生物存在时，并不诱导共生结构，而是主要刺激蒺藜苜蓿（*Medicago truncatula*）形成新的侧根（lateral roots, LRs），且这种能力在包括非豆科植物在内的多种植物中保守存在。
过去的研究已大幅推进了对根瘤器官发生分子机制的理解，特别是细胞分裂素在该过程中的重要性。细胞分裂素生物合成在NF感知下游被激活，随后被细胞分裂素受体CYTOKININ RESPONSE 1（CRE1）感知——CRE1同时也是侧根发育的负调控因子——进而控制NODULE INCEPTION（NIN）转录因子的表达。NIN又直接激活LATERAL ORGAN BOUNDARY DOMAIN 16（LBD16）转录因子的表达，LBD16在根皮层控制局部生长素产生，导致皮层细胞分裂。有趣的是，LBD16是豆科植物中根瘤器官发生和侧根发育的共同调控因子，这提示侧根形成与根瘤器官发生之间存在紧密联系。然而，NF刺激侧根形成的具体分子通路及其与根瘤器官发生的重叠程度这一问题仍有待阐明。此前研究表明，NF诱导的蒺藜苜蓿侧根形成不依赖MtCRE1，但需要共生信号通路（common symbiosis signaling pathway, CSSP）。为理解CSSP下游促进根系发育的分子机制，研究人员通过转录组分析鉴定了生长素信号基因*MtIAA7*（Auxin/INDOLE-3-ACETIC ACID 7）。
生长素调控侧根发育的所有主要阶段。在拟南芥和蒺藜苜蓿主根中，一个生长素最低值区域决定了发育窗口，该处生长素的瞬时积累导致中柱鞘（pericycle）创始人细胞特化并触发其首次不对称分裂。AUX/IAA蛋白是生长素信号的负调控因子家族，包含三个保守结构域：结构域I介导与TOPLESS共抑制因子的互作，结构域II携带degron基序直接结合生长素并促进泛素化降解，结构域III/IV（PB1结构域）介导与ARF蛋白的互作。目前，在蒺藜苜蓿中尚未有AUX/IAA基因被功能鉴定，且已鉴定的侧根发育调控因子大多同时参与根瘤器官发生。
### 研究内容与主要结论
本研究旨在解析NFs刺激侧根形成的分子机制及其与根瘤器官发生途径的关系。研究人员通过反向遗传学、转录组学、系统发育分析、跨物种互补和蛋白互作分析等手段，获得以下主要发现。
### 关键技术与方法
研究人员使用了以下主要技术方法：利用蒺藜苜蓿*Mtnin-1*和*Mtlbd16*突变体进行根系表型分析；对NF、生长素类似物（1-萘乙酸，NAA）及其组合处理的根部进行批量RNA测序（RNA-seq）；利用Tnt1插入突变体（*Mtiaa7*）进行反向遗传学分析；构建启动子-GUS和蛋白-YFP融合进行表达与亚细胞定位分析；在烟草BY-2原生质体中利用DR5:GFP报告系统验证蛋白对生长素信号的抑制活性；利用拟南芥T-DNA插入突变体（*Atiaa29-1*、*Atiaa29-2*）和番茄CRISPR-Cas9编辑株系（*Sliaa29*、*Sliaa36*）进行同源基因功能分析；利用单核RNA测序（single-nuclei RNA-seq）鉴定共表达的ARF候选基因；利用split-luciferase和双分子荧光互补（BiFC）验证蛋白互作。样本来源包括蒺藜苜蓿A17和R108生态型、拟南芥Col-0、番茄Micro-Tom品种。
### 研究结果
#### NFs激活独立于根瘤器官发生的根系发育程序
利用完全阻断根瘤器官发生的*Mtnin-1*突变体进行NF处理实验，发现*Mtnin-1*和野生型（WT）植株在NF处理下均显著增加侧根数量，且NF与生长素的协同效应在*Mtnin-1*中依然存在。这表明MtNIN不是NF刺激侧根形成所必需的。转录组分析显示，在生长素生物合成基因中，只有*MtYUC2*被NF单独诱导，且该诱导在*Mtnin-1*中仍然存在。pMtYUC2:GUS活性分析表明NF处理使该基因表达略微增强，但表达仍局限于中柱鞘细胞。这提示NF感知在中柱鞘细胞中激活生长素生物合成，且不依赖MtNIN。
#### MtIAA7是侧根形成的负调控因子
通过筛选Tnt1插入突变体获得*Mtiaa7*突变体，在对照条件下*Mtiaa7*幼苗比野生型样（WTL）植株形成显著更多的侧根，表明MtIAA7作为根系发育的负调控因子发挥作用。*Mtiaa7*侧根密度在NF处理后不再增加，表明MtIAA7参与NF刺激侧根形成的调控。启动子活性分析显示*MtIAA7*在侧根发育早期阶段于维管组织和侧根原基分裂细胞中表达。侧根原基分期定量表明*Mtiaa7*突变体在4天时具有更少的IV期原基但更多的晚期VI期原基，说明MtIAA7不控制侧根起始，而是作为中间原基发育阶段的负调控因子。亚细胞定位实验证实MtIAA7蛋白定位于细胞核。原生质体共转化实验验证了MtIAA7对生长素信号的负调控活性。生长素敏感性实验显示*Mtiaa7*对生长素超敏感。结瘤实验显示*Mtiaa7*的根瘤数量、固氮酶活性和根瘤形态均无显著差异，表明MtIAA7不参与根瘤发育。
#### MtIAA7及其拟南芥直系同源基因AtIAA29是保守的侧根发育负调控因子
利用290个链型植物物种的蛋白序列进行系统发育分析，IAA7家族在被子植物中起源并在双子叶植物分化前发生复制。拟南芥中AtIAA29被鉴定为IAA7的唯一直系同源基因，但此前无侧根形成功能报道。AtIAA29启动子活性分析显示其在侧根发育早期中柱鞘细胞和原基发育过程中表达。两个独立的*Atiaa29*突变等位基因均比Col-0野生型形成显著更多的侧根和更高的侧根密度，表明AtIAA29同样负调控侧根形成。跨物种互补实验表明，蒺藜苜蓿和拟南芥的启动子与编码序列在功能上保守，MtIAA7可以替代AtIAA29在拟南芥中调控侧根形成。
#### IAA7在番茄侧根形成中的功能保守
番茄中存在两个IAA7旁系同源基因SlIAA29和SlIAA36。利用CRISPR-Cas9技术获得*Sliaa29*和*Sliaa36*单突变体及*Sliaa29-1-Sliaa36-1*双突变体。*Sliaa29*突变体比WTL形成显著更多的侧根，而*Sliaa36*突变体对侧根形成的影响不明显，双突变体也表现显著更多的侧根。这表明在番茄两个同源基因中，SlIAA29起负调控侧根发育的作用。
#### MtIAA7与特定的蒺藜苜蓿ARF蛋白互作
通过单核RNA测序鉴定出与MtIAA7在同一细胞或组织中表达的六个MtARF基因，并结合文献信息优先筛选出七个候选MtARF。Split-luciferase实验显示，MtrunA17Chr2g0301251和MtARF24（MtrunA17Chr8g0389081）与MtIAA7表现出最强的互作信号。BiFC实验进一步在烟草表皮细胞核中验证了MtIAA7与这两个ARF蛋白的互作。这两个蛋白是拟南芥AtARF7/19（已明确的侧根形成正调控因子）的最接近同源物，表明一个保守的生长素信号模块位于侧根发育调控的下游。
### 总结与讨论
本研究表明，NFs通过中柱鞘细胞中的局部生长素生物合成触发侧根形成，该过程不依赖NIN和根瘤器官发生途径。提出的模型为：NFs触发中柱鞘细胞中生长素局部合成，导致MtIAA7降解，解除对侧根原基发育的抑制，从而促进侧根形成。MtIAA7降解后释放MtARF24和MtrunA17Chr2g0301251的活性，这些是拟南芥AtARF7/19的同源蛋白，构成一个保守的生长素信号模块。IAA7功能在具有不同共生能力的物种（豆科、拟南芥、番茄）中保守，表明其根系架构调控作用早于结瘤的进化出现，可能代表一个祖先的侧根发育调控模块。这一发现揭示了NF介导的侧根形成调控通过共选（co-option）保守的生长素信号通路而进化，该通路独立于细胞分裂素信号和NIN依赖的根瘤器官发生途径。
