《Metabolites》：Lactobacillus johnsonii N5 Supernatant Protects RPMI-2650 Cells from HDM-Induced Injury in Association with Suppression of the NR4A1–IRE1–XBP1-Mediated Unfolded Protein Response
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背景/目的：屋尘螨（HDM）是引起鼻上皮细胞损伤并参与变应性鼻炎病理生理的重要变应原。约氏乳杆菌（Lactobacillus johnsonii）N5上清液（N5sup）具有潜在保护作用，但其分子机制尚不清楚。方法：研究人员以HDM、N5sup及两者联合处理R
背景/目的：屋尘螨（HDM）是引起鼻上皮细胞损伤并参与变应性鼻炎病理生理的重要变应原。约氏乳杆菌（Lactobacillus johnsonii）N5上清液（N5sup）具有潜在保护作用，但其分子机制尚不清楚。方法：研究人员以HDM、N5sup及两者联合处理RPMI-2650人鼻上皮癌细胞。结果：HDM刺激诱导一定转录改变，与对照组相比，HDM处理细胞中鉴定出221个差异表达基因，主要富集于未折叠蛋白反应（UPR）的IRE1–XBP1分支。综合研究显示HDM上调NR4A1–IRE1–XBP1信号通路（NR4A1、ERN1/IRE1、XBP1表达升高）；qRT-PCR与Western blotting证实N5sup强烈抑制HDM诱导的上述分子增加；蛋白互作网络进一步确认NR4A1、IRE1、XBP1构成中心枢纽。结论：N5sup通过关联NR4A1–IRE1–XBP1通路保护RPMI-2650细胞抵御HDM损伤，该信号轴可作为变应性气道疾病益生菌干预的潜在治疗靶点。
研究背景与立项依据：屋尘螨（HDM）尤其是粉尘螨（Dermatophagoides pteronyssinus）是全球范围内诱发变应性鼻炎、变应性哮喘与特应性皮炎的核心气传变应原，其携带的蛋白酶可破坏气道上皮屏障，促进胸腺基质淋巴生成素（TSLP）、IL-25、IL-33等警报素释放，驱动Th2型炎症。内质网（ER）是分泌蛋白与膜蛋白折叠场所，当错误折叠蛋白蓄积引发ER应激时，细胞激活进化保守的未折叠蛋白反应（UPR），其核心传感器包括IRE1、PERK与ATF6；其中IRE1通过切除XBP1 mRNA中26 nt内含子产生剪接型XBP1s，调控ER扩张与ER相关降解（ERAD）。NR4A1（Nur77）作为孤儿核受体，可响应氧化应激与炎症信号，但其在气道上皮ER应激中的直接作用尚未明确。近十年益生菌研究正从活菌向灭活菌体（paraprobiotics）与后生元（postbiotics，微生物代谢物/副产物）过渡，约氏乳杆菌N5（Lactobacillus johnsonii N5，CCTCC M2023104）分离自耐热断奶仔猪，具有免疫调节潜力，但其无细胞上清液（N5sup）能否通过抑制UPR缓解HDM鼻上皮损伤属机制空白。该研究即在此基础上探究N5sup的保护效应与分子通路，论文发表于《Metabolites》。
主要关键技术方法：研究人员采用约氏乳杆菌N5厌氧培养后离心取无细胞上清经0.22 μm过滤制N5sup；以人鼻上皮癌细胞系RPMI-2650（BNCC353694）为模型，HDM提取自Greer Laboratories（XPB82D3A2.5）；通过CCK-8剂量筛选确定HDM 150 μg/mL诱导、N5sup 10%（v/v）保护浓度，设对照、单N5sup、单HDM、HDM预孵30 min后加N5sup共孵24 h四组；转录组采用BGI T7平台RNA-seq，NOISeq法筛差异基因，Metascape/DAVID做GO与KEGG富集、GSEA 4.1.0做基因集富集、STRING建蛋白互作网；qRT-PCR用2???CT法检NR4A1/ERN1/XBP1S；Western blotting检Occludin、Claudin-1、Claudin-4、IRE1、NR4A1、XBP1s；Calcein-AM活细胞染色与TUNEL凋亡染色定量损伤；统计用SPSS 23单因素ANOVA加Tukey事后检验，GraphPad Prism 9绘图。
研究结果
3.1 N5上清液缓解HDM诱导的RPMI-2650细胞活力下降：Calcein活细胞染色显示HDM显著降低细胞数并增加TUNEL阳性凋亡率（p < 0.05），10% N5sup单独处理无显著影响，而N5sup+HDM较HDM组细胞数回升、TUNEL阳性率下降（p < 0.05），表明N5sup减轻HDM致凋亡与存活丧失。
3.2 转录组学分析锁定ER应激为核心调制通路：RNA-seq在HDM vs 对照中鉴定221个专属差异基因，火山图与热图显示N5sup+HDM表达谱回向对照聚类；GSEA证实HDM显著富集hallmark UPR基因集（FDR q < 0.05），核心基因含XBP1、ATF4、ERN1、HSPA5，N5sup+HDM使UPR富集减弱（FDR q < 0.25）并下调HERPUD1、CHAC1，说明N5sup经抑制UPR发挥保护。
3.3 N5sup抑制NR4A1–IRE1–XBP1信号轴：核受体相关基因热图与STRING互作网显示NR4A1–IRE1–XBP1构成中心枢纽；qRT-PCR中HDM上调NR4A1、ERN1、XBP1S转录（p < 0.05），N5sup+HDM回降；Western blotting同步显示HDM降低紧密连接蛋白Occludin、Claudin-1、Claudin-4并升高IRE1、NR4A1、XBP1s，N5sup共处理逆转上述蛋白变化，确认该轴为N5sup作用节点。
讨论部分总结：讨论指出HDM经蛋白酶破屏障并促Th2炎症已成共识，本研究新增证据表明HDM在鼻上皮激活IRE1–XBP1分支UPR并伴紧密连接丢失与凋亡，与慢性鼻窦炎及哮喘中ER应激促炎报道一致；创新点是将NR4A1列为该轴上游应激响应转录因子，虽NR4A1直接结合IRE1/XBP1启动子未证，但单细胞测序中HDM暴露肺上皮NR4A1差异表达提供支持；N5sup中3-苯基乳酸、N-乙酰鸟氨酸、DL-乳酸等代谢物（见前期非靶向代谢组）可能经抗氧化/抗炎间接抑UPR，但需活性导向分离确证；局限包括单一细胞系缺免疫微环境、NR4A1→IRE1因果链未敲除验证、活性成分未定、未扩至其他变应原。结论部分译文：本研究结论为N5sup有效保护RPMI-2650人鼻上皮癌细胞抵御HDM诱导损伤，该保护关联抑制NR4A1–IRE1–XBP1相关UPR通路；HDM显著激活此轴并伴转录紊乱与UPR富集，N5sup在转录与翻译水平回降NR4A1、IRE1、XBP1s，提示该轴为HDM上皮损伤调控节点，N5sup有望作为变应性鼻炎等气道病的后生元干预选项，未来需推进临床转化与活性成分鉴定。
