Menin通过调控染色质可及性及晚期出生神经元中EphA4的激活来协调皮质发生

《Cell Reports》：Menin orchestrates corticogenesis via regulation of chromatin accessibility and activation of EphA4 in late-born neurons

　　

哺乳动物大脑新皮质的发育受到表观遗传机制的严格调控。然而，表观遗传修饰在基因调控中的作用及其对新皮质功能的影响仍知之甚少。研究人员在此证明，由多发性内分泌腺瘤病1型（multiple endocrine neoplasia type 1, Men1）基因编码的Menin对新皮质神经发生至关重要。Men1缺陷破坏了分层新皮质的形成，尤其是在上层神经元中。在Men1缺陷的晚期出生神经元中，向最终位置的迁移受损，伴随神经元极化缺陷。机制研究揭示，Menin调控对神经元发育至关重要基因的转录起始位点（transcriptional start sites, TSS）处的全局染色质可及性。Menin缺失主要减少启动子区域的H3K4me3沉积。值得注意的是，在Men1缺陷背景下，于晚期出生神经元中互补表达EphA4可减轻极化缺陷。这些发现支持了Menin在皮质发生中的重要性，并为大脑新皮质的形成提供了见解。

研究背景与立项依据

哺乳动物新皮质的六层状结构依赖神经前体细胞的时空有序增殖、分化与径向迁移，而表观遗传修饰（特别是组蛋白修饰与染色质可及性）被认为是协调这一过程的核心枢纽。已有研究提示混合谱系白血病蛋白1（mixed-lineage leukemia protein-1, MLL1）、增强子同源物2（enhancer of zeste homolog 2, EZH2）、SETDB1等染色质修饰酶参与神经发生，但作为支架蛋白的Menin（由Men1基因编码，既往多与内分泌肿瘤相关）在皮质发生期神经前体细胞及新生神经元中的功能长期未被阐明。尽管Men1全身敲除小鼠因胚胎致死难以研究，但其作为MLL1/2复合体成员催化H3K4me3的辅因子角色，提示其可能通过表观遗传重编程影响神经元出生、迁移与极化。本研究据此提出：Menin是否及如何在新皮质发育中建立活性染色质景观、调控层特化与放射状迁移，是一个尚未解决的关键问题。

研究人员以小鼠为模型，构建Nestin-Cre;Men1^flox/flox（MEN1-NCKO）与Emx1-Cre;Men1^flox/flox（MEN1-ECKO）两种条件敲除（conditional knockout, cKO）品系，规避全身缺失致死性，结合子宫内电转染（in-utero electroporation, IUE）、单核RNA测序（single-nucleus RNA sequencing, snRNA-seq）、转座酶可及染色质测序（assay for transposase-accessible chromatin with sequencing, ATAC-seq）、切割下靶标与标记测序（Cleavage Under Targets and Tagmentation with sequencing, CUT&Tag-seq）及免疫沉淀质谱（immunoprecipitation-mass spectrometry, IP-MS），在E15.5–E18.5及出生后P3–P21时间窗解析Menin缺失对神经发生、层形成、迁移、极化及表观基因组的影响，并定位下游效应因子EphA4进行救援实验。论文发表于《Cell Reports》。

主要关键技术方法概括

研究人员采用Nestin-Cre与Emx1-Cre驱动Men1^flox/flox条件敲除小鼠（样本来源于厦门大学动物中心C57BL/6J与CD1背景交配队列），以IUE在E12.5–E15.5野生型或cKO胚胎中敲低/敲除Men1并追踪GFP标记细胞迁移；通过BrdU脉冲标记量化前体增殖；snRNA-seq（10× Genomics，E18.5端脑单核）解析转录轨迹；Flash-Tag标记E15.5新生神经元后经流式分选获取晚期出生神经元，行ATAC-seq与Menin/H3K4me3/H3K27me3/H3K9ac/RNA Pol II的CUT&Tag-seq；IP-MS鉴定Menin互作蛋白；最后以pCAG-EPHA4-mCherry共电转进行功能救援。所有分析均设同窝对照（MEN1-F/F或MEN1-F/+）。

研究结果

Menin在大脑新皮质中高表达

免疫染色显示Menin在胚胎新皮质广泛表达，皮质板（cortical plate, CP）中DCX⁺未成熟神经元与脑室区/亚脑室区（ventricular zone/subventricular zone, VZ/SVZ）内Pax6⁺放射状胶质细胞（radial glial cells, RGCs）及Tbr2⁺中间前体细（intermediate progenitor cells, IPCs）均强阳性，提示其贯穿前体–神经元连续体。

Menin缺陷损害神经发生

NCKO与ECKO皮质E14.5–E18.5的VZ/SVZ、中间区（intermediate zone, IZ）、CP厚度减薄；Pax6⁺ RGCs与Tbr2⁺ IPCs数量下降，BrdU⁺增殖细胞减少，NeuroD2⁺新生神经元降低，但凋亡未增。表明Menin缺失主要在胚胎晚期耗竭IPC池并抑制神经前体增殖与产出。

Men1缺陷导致分层新皮质畸形

P7与P21皮质中Cux1⁺（II–IV层）、Brn2⁺（II/III层）、Satb2⁺上层神经元面积/厚度减少，Tbr1⁺（VI层）、Ctip2⁺（V层）、Foxp1⁺深层增厚，Tbr1⁺细胞在VI层下异常堆积。两款Cre品系表型一致，证实Menin缺失特异性破坏上层神经元为主的分层组织。

Men1耗竭损害晚期出生神经元的放射状迁移与层身份

IUE于E13.5–E15.5敲低Men1使神经元停滞于IZ/深CP，无法抵达上层；Neurod启动子Cre在生后神经元中诱导分布异常，证明细胞自主性。E15.5标记细胞在cKO中E18.5聚于IZ、P3仍散在CP，伴随Cux1⁺上层身份丢失与Ctip2⁺深层偏移，说明Menin主导晚期出生神经元在CP内运动期及IZ–CP多极–双极转换。

Menin耗竭改变皮质神经元极化

E15.5 IUE后3天cKO神经元领先突（leading process）延长，P3时领先突取向偏离基底膜，高尔基体（GM130⁺）角度异常，多极–双极转换受阻；P21锥体神经元形态异质。表明Menin是迁移期极化建立的必要条件。

晚期出生神经元层转录身份依赖Menin功能

snRNA-seq（E18.5）显示兴奋神经元轨迹中，Men1 cKO组轨迹1/4细胞比例减少、轨迹2进展延迟；晚期出生神经元亚群伪时间分布偏移，Eomes、Neurod2、Unc5d、Pou3f2、Cux1下调，Bcl11b、Ldb2上调。GO富集于神经发生/分化，证明Menin缺失打乱层签名转录程序。

Menin通过启动子染色质可及性调控皮质发育

ATAC-seq（E18.5 FACS分选E15.5 Flash-Tag⁺晚期神经元）显示cKO在TSS附近可及性峰值丢失67487个、获得5229个，峰值向TSS上游5 kb偏移；DAR与RNA-seq差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）交集176个富集神经元发育，确认Menin维持TSS近端开放景观。

Menin促进H3K4me3沉积与转录激活

CUT&Tag-seq表明Menin峰富集于TSS上游5 kb，缺失后H3K4me3在TSS ±5 kb强度显著下降，按Menin富集五分位H3K4me3单调上升；IP-MS鉴定Menin结合COMPASS复合物KMT2A/KMT2B。H3K27me3略升、H3K9ac略降、RNA Pol II占用减，均为次级变化。结论：Menin以辅因子身份携MLL/COMPASS促H3K4me3、开启动子转录。

Menin通过激活EphA4介导神经元极化

三联交集（DEG∩Menin峰∩H3K4me3峰）得168个神经元发育基因，EphA4启动子Menin/H3K4me3/RNA Pol II信号共丢失，snRNA中EphA4表达降低。E15.5共电转EPHA4-mCherry不改变迁移距离，但纠正cKO领先突基底取向缺陷；过表达不挽救神经发生。即Menin→H3K4me3→EphA4轴专门恢复极化而非增殖或位移。

讨论与结论翻译

建立新皮质细胞身份依赖多染色质修饰的时序调控。本研究证明表观调节因子Menin通过组蛋白修饰重塑激活神经元发育因子，主导皮质发生。Men1缺失造成RGC/IPC Transit-amplifying缺陷、上层神经元放射状迁移停滞、多极–双极转换异常及EphA4依赖的极化紊乱；机制上Menin锚定COMPASS于TSS、选择性维持亚群H3K4me3而非全局丢失，从而决定晚期出生神经元层身份与迁移能力。该轴连接染色质可及性–H3K4me3–EphA4–Reelin/Dab1信号，为理解多发性内分泌腺瘤病1型（MEN1）变异相关神经发育障碍（如脑室旁结节异位的罕见病例）提供机制线索。局限在于未涉及胶质生成与中间神经元、未解析Menin与其他表观因子动态互作。综上，Menin作为染色质修饰辅因子，在胚胎皮质形成与生后神经元成熟中通过H3K4me3依赖程序协调神经发生、层形成与极化。