肥厚型心肌病（HCM）患者血浆来源细胞外囊泡（EV）的研究

《iScience》：Investigation of plasma-derived extracellular vesicles in hypertrophic cardiomyopathy patients

　　

中文摘要：
肥厚型心肌病（HCM）是一种由基因决定的心脏病，具有显著的临床异质性，反映潜在疾病机制的特定循环生物标志物有限。本研究探讨了血浆来源细胞外囊泡（EV）是否能够捕获HCM患者中与疾病相关的分子特征。研究人员采用流式细胞术以及靶向和非靶向蛋白质组学分析，对血浆EV的大小、细胞来源和蛋白质载荷进行了表征。虽然两组间EV的大小和浓度相当，但HCM患者表现出血小板来源EV（CD41a⁺）的富集，以及中性粒细胞来源（CD66b⁺）和淋巴管内皮细胞来源（CD310⁺）EV的减少。蛋白质组学分析揭示了与血小板活化和血栓炎症相关的EV相关蛋白。由EV衍生的多变量蛋白特征能够将患者与对照组区分开来，其性能与基于血浆的模型相当，且不受年龄影响。这些发现表明，血浆来源EV捕获了参与HCM的关键生物学通路，并可能补充生物标志物发现策略。

论文主体内容解读：

**研究背景与问题提出**

肥厚型心肌病（Hypertrophic Cardiomyopathy, HCM）是最常见的孟德尔单基因心肌病，影响人群中约1/500的个体，主要以心脏异常增厚为特征。该病主要由编码心脏肌小节或Z盘蛋白的基因中的常染色体显性遗传可作用变异引起。尽管在理解HCM遗传基础方面取得了显著进展，但这一知识对治疗和预后的影响有限，主要原因在于对驱动疾病进展的因素缺乏了解。目前，HCM的临床管理结合了基因检测、心电图、运动试验、心脏影像学（超声心动图和心脏磁共振）以及临床红旗征象来评估表型、监测疾病进展和进行预后分层。然而，循环生物标志物在HCM中的临床实用性仍然有限。虽然N末端前脑钠肽（NT-proBNP）和高敏心肌肌钙蛋白（hs-cTns）与疾病严重程度和不良结局相关，但其纳入常规临床决策仍在发展中。反映心肌纤维化、炎症和内皮功能障碍的其他生物标志物也显示出潜力，但需要更有力的验证。因此，需要新的生物标志物来更好地定义诊断和跟踪疾病进展。

细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）是一种异质性的细胞来源膜性纳米颗粒群体，释放到几乎所有生物体液中。在生物发生过程中，EV获得表面分子和腔内载荷（包含蛋白质、核酸和脂质），紧密反映其供体细胞的生理或病理状态。EV的分子组成并非静态，而是响应细胞应激、活化或疾病而动态变化。重要的是，EV膜上表达的表面标志物谱系提供了其细胞来源的宝贵信息，使EV能够追溯到特定组织或细胞类型。在心血管疾病背景下，大量研究表明心力衰竭患者循环EV水平升高，特定EV亚群的丰度在慢性和急性心脏病患者之间存在差异。近期发现表明，EV不仅是很有前景的生物标志物，还是心血管疾病病理生理学中的活跃分子介质。然而，在HCM中，关于EV对疾病发病机制贡献的研究日益受到关注，至少在体外模型中，携带特定蛋白质和miRNA的EV似乎能促进心肌细胞肥大。但很少有研究涉及HCM患者血浆来源EV的循环谱。鉴于目前HCM缺乏精确的诊断和预后生物标志物，深入表征该疾病中循环EV及其分子载荷可能具有临床变革意义。因此，这项单中心、横断面病例对照研究的主要目标是全面表征HCM患者与健康志愿者相比EV的亚细胞来源，次要目标是表征EV的蛋白质载荷以探索其作为诊断工具的潜力。

**研究开展与主要结论**

研究人员共招募了46名HCM患者（中位年龄61岁）和31名对照者（CTRL，中位年龄48岁）。通过差速超速离心和尺寸排阻色谱法（SEC）分离血浆EV，并结合纳米颗粒跟踪分析（NTA）、透射电子显微镜（TEM）、蛋白质印迹（WB）、流式细胞术、靶向Olink蛋白质组学和非靶向蛋白质组学进行表征。研究发现，虽然HCM患者与对照组相比EV大小和浓度无显著差异，但HCM患者表现出血小板来源EV（CD41a⁺）的显著富集，以及中性粒细胞来源（CD66b⁺）和淋巴管内皮细胞来源（CD310⁺）EV的减少。靶向蛋白质组学显示EV相关蛋白纤溶酶原激活物抑制剂-1（PAI-1）和P-选择素（CD62P）水平升高，提示血小板α颗粒活化和抗纤溶活性增强。全血浆蛋白质组学分析显示更广泛的止血、炎症和纤维化特征。多变量蛋白特征模型显示，EV蛋白组合的判别性能与血浆模型相当且不受年龄影响。体外实验显示，HCM患者来源的EV可上调THP-1单核细胞中炎症细胞因子IL-1α和IL-6的基因表达。该研究发表在《iScience》。

**关键技术方法**

本研究采用多项关键技术：1）通过差速超速离心和尺寸排阻色谱法（SEC）从血小板贫乏血浆中分离EV，并用NTA和TEM进行物理表征；2）运用流式细胞术在CFSE⁺事件门控内定量不同细胞来源的EV亚群（CD41a⁺、CD66b⁺、CD310⁺等）；3）应用Olink邻近延伸分析（PEA）进行靶向蛋白质组学检测92种心血管相关蛋白；4）采用液相色谱-质谱联用（LC-MSE）进行非靶向蛋白质组学分析；5）使用STRING数据库进行功能富集分析；6）利用逻辑回归和贪婪前向特征选择构建分类模型。研究样本来自意大利米兰Fondazione IRCCS Ca' Granda Ospedale Maggiore Policlinico心肌病单元连续入组的46名HCM患者和31名健康对照者。

**研究结果**

**研究人群的临床特征**：通过比较46名HCM患者与31名对照者的临床数据发现，HCM患者的总白细胞计数和中性粒细胞计数显著升高，导致中性粒细胞-淋巴细胞比率（NLR）增加。超声心动图显示HCM患者室间隔厚度、后壁厚度、最大室壁厚度和左心室质量指数显著增加，LVEF略低而E/e'比值升高。76%的HCM患者检测到晚期钆增强（LGE）。基因检测显示46.5%的患者携带致病或可能致病变异，最常见于MYBPC3和MYH7基因。

**血浆来源EV的表征**：通过NTA分析发现HCM和CTRL组间EV中位大小和浓度相当。WB确认了EV标志物Alix、Flotillin-1和β1-整合素的表达，流式细胞术检测到四旋蛋白CD9和CD63，TEM确认了囊泡结构的完整性。内质网蛋白钙联蛋白仅在细胞裂解物中检测到，白蛋白仅在血浆样本中检出，排除了细胞污染。

**血浆来源EV相对细胞来源的评估**：在CFSE⁺ EV群体中，HCM患者的血小板来源EV（CD41a⁺）显著富集（中位值从23.7%升至27.4%，p=0.039），而中性粒细胞来源EV（CD66b⁺）从2.88%降至1.55%（p=0.045），淋巴管内皮细胞来源EV（CD310⁺）从2.13%降至1.21%（p=0.020）。单核细胞、血管内皮细胞和T淋巴细胞来源的EV亚群无显著差异。

**血浆和血浆来源EV的蛋白质组学分析**：全血浆分析显示HCM患者的NT-proBNP（+91%）、组织纤溶酶原激活物（tPA；+16.2%）、生长分化因子15（GDF15；+10.9%）、CD163（+5.1%）、血管性血友病因子（vWF；+10%）、表面活性蛋白D（SP-D；16.8%）和半乳糖凝集素-3（+65%）显著升高。EV相关蛋白分析显示PAI-1和P-选择素在HCM中分别显著升高56%和76%（均p<0.01）。疾病-基因关联富集分析将这些蛋白聚类于血栓形成相关通路。非靶向蛋白质组学鉴定出三种在HCM EV中显著升高的蛋白：氨肽酶N（ANPEP）、α-1-酸性糖蛋白1（ORM1）和血清淀粉样蛋白A-4（SAA4）。

**分类模型性能**：通过贪婪前向特征选择结合留一法交叉验证，EV蛋白组合（E-选择素、IL-1受体2型和博来霉素水解酶）达到了AUC 0.90的判别性能，与血浆模型的AUC 0.95无统计学显著差异。含NT-proBNP的血浆模型AUC最高（0.95），而剔除NT-proBNP后血浆模型AUC降至0.82。重要的是，EV蛋白与年龄无显著相关性，而部分血浆蛋白（如NT-proBNP）与年龄中等相关，提示EV特征可能更具疾病特异性。

**血浆来源EV对THP-1单核细胞炎症细胞因子表达的影响**：体外实验显示，HCM患者来源的EV处理THP-1单核细胞24小时后，炎症细胞因子IL-1α（+23%，p=0.014）和IL-6（约两倍，p=0.01）的基因表达显著增加，而抗炎细胞因子IL-10无变化。

**讨论与结论**

本研究通过单中心横断面病例对照设计，对46名HCM患者和31名健康对照者进行了EV亚细胞表征和蛋白质组学分析。主要发现表明，尽管HCM患者血浆来源EV的大小和浓度与对照组无差异，但其细胞来源发生了改变（血小板来源EV增加，中性粒细胞和淋巴管内皮细胞来源EV减少），内部蛋白质载荷谱与血小板活化和血栓炎症过程一致。这些发现与既往报道的HCM中血栓炎症通路上调的证据相符。血小板来源EV的增加发生在血小板计数不变的情况下，提示其可作为血小板活化的早期敏感标志物。中性粒细胞来源EV的减少可能反映中性粒细胞激活状态的改变或EV的快速再摄取。淋巴管内皮细胞来源EV的减少可能反映HCM中慢性血流动力学应激下的淋巴管内皮稳态改变。EV蛋白特征（E-选择素、IL-1受体2型、博来霉素水解酶）能够以不受年龄影响的稳健方式区分HCM患者与健康对照，补充了传统血浆生物标志物策略。研究的局限性包括：单中心设计和相对较小的样本量限制了普遍性；缺乏高血压继发性心脏肥厚的阳性对照组；EV分离过程中血小板相关物质的残余污染不能完全排除；特征选择和假设检验未使用嵌套交叉验证框架。总体而言，血浆来源EV的联合亚细胞和蛋白质组学表征在HCM中识别出与血小板活化和血栓炎症相关的独特分子模式，EV分析可作为传统血浆生物标志物的补充策略，在发现阶段和对疾病特异性生物学需要深入理解的场景中尤其有价值。