《Diagnostics》：Histology-Correlated FTIR Chemical Imaging of Fungal Infection-Associated Tissue Compartments in Human Skin: A Proof-of-Concept Study
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背景/目的：真菌性皮肤感染通常通过临床检查和常规组织病理学进行评估，包括苏木精-伊红（HE）、过碘酸-雪夫（PAS）和格罗科特六亚甲基四胺银（GMS）染色。然而，这些方法提供的空间分辨生化信息有限。这项概念验证研究探讨了傅里叶变换红外（FTIR）化学成像是否能
背景/目的：真菌性皮肤感染通常通过临床检查和常规组织病理学进行评估，包括苏木精-伊红（HE）、过碘酸-雪夫（PAS）和格罗科特六亚甲基四胺银（GMS）染色。然而，这些方法提供的空间分辨生化信息有限。这项概念验证研究探讨了傅里叶变换红外（FTIR）化学成像是否能够识别与组织学定义的人类皮肤真菌感染相关组织区室相关的生化模式。方法：研究了具有真菌感染组织学证据的存档福尔马林固定、石蜡包埋皮肤样本。研究组包括19名患者，其中12名满足定量FTIR分析的组织学和技术资格标准。这12个独立生物学病例产生了46个组织学定义的感兴趣区（ROIs），包括16个真菌感染相关ROIs、14个角化过度/角化组织ROIs和16个活性表皮ROIs。ROI分配以相应的HE、PAS和GMS染色切片为指导。结果：与活性表皮和角化组织相比，真菌感染相关组织区室显示出部分独特的光谱特征。最显著的探索性差异出现在900–1300 cm?1指纹区。病例水平统计分析显示，在错误发现率校正后，真菌感染相关组织与活性表皮在约1185和1240 cm?1处存在显著差异，而与角化组织仍有大量重叠。病例水平主成分分析在生物学聚合后保留了组织相关光谱结构，尽管真菌感染相关组织和角化组织显示出部分重叠。无监督聚类进一步证明了与组织学可识别组织结构相对应的空间连贯光谱区室。结论：FTIR化学成像可能通过提供无标记、空间分辨的关于真菌感染相关组织区室的生化信息来补充常规组织病理学。由于真菌成分嵌入在周围的角化和上皮组织中，观察到的光谱特征应被解释为探索性的感染相关组织特征，而非真菌特异性诊断生物标志物。需要进行更大规模的独立研究并进行病例级验证，才能考虑诊断应用。
**论文解读：基于组织学相关的傅里叶变换红外化学成像对人类皮肤真菌感染相关组织区室的研究**
**一、研究背景与目的**
真菌性皮肤感染是皮肤科及皮肤病理学中最常见的感染性疾病之一，可由皮肤癣菌、酵母菌和非皮肤癣菌霉菌引起，常累及富含角蛋白的结构，如角质层、毛囊和甲板。临床上，此类感染的常规诊断流程通常结合临床评估、直接镜检、真菌培养、组织病理学检查以及日益增多的分子生物学方法。然而，这些方法各有局限性：氢氧化钾直接镜检虽快速但依赖操作者经验；真菌培养能够进行菌种鉴定但需时较长且要求病原体具有活性；传统组织病理学染色如HE、PAS和GMS虽能提供形态学信息，但真菌成分可能稀少、被角蛋白掩盖或难以与人工假象区分。值得注意的是，有研究报告显示，在足癣的汇总分析中，KOH涂片的敏感度为73.3%、特异度为42.5%，真菌培养的敏感度为41.7%、特异度为77.7%（以临床评估为参考标准）；在侵袭性真菌伤口感染的组织病理学评估中，PAS和GMS染色检测真菌的敏感度分别为56%和85%。这些数据表明传统方法的诊断性能高度依赖具体应用场景，且均无法直接提供空间分辨的组织生化组成信息。
傅里叶变换红外光谱及FTIR化学成像技术能够测量生物样品的内在分子振动，反映蛋白质、脂质、核酸、碳水化合物和细胞外基质成分等主要生化类别的信息。与显微镜联用时，FTIR光谱成像能够实现组织切片的无标记、空间分辨化学图谱绘制，已被越来越多地探索用于数字组织病理学和组织分类。在真菌学领域，红外光谱已被报道可用于念珠菌和皮肤癣菌的快速鉴定以及甲真菌病的诊断。然而，既往研究多集中于微生物分离株、甲板材料或整体测量，缺乏直接在皮肤组织切片中对真菌结构进行组织学相关的化学成像研究。这一区别至关重要，因为皮肤中的真菌常嵌入或邻近角化组织，光谱信号必须与角蛋白、脂质和周围表皮结构产生的强生化贡献相区分。因此，本研究旨在探讨FTIR化学成像能否识别与组织学定义的真菌感染相关组织区室相对应的空间连贯生化模式，并系统评估其作为常规组织病理学补充方法的可行性。
**二、研究设计与主要技术方法**
本研究为一项回顾性概念验证研究。初始研究组包含19例具有真菌感染组织学证据的福尔马林固定石蜡包埋人类皮肤组织病例，其中12例满足定量FTIR分析的组织学和技术资格标准，最终构成12个独立生物学病例的定量数据集。研究对连续切片进行HE、PAS和GMS染色作为组织学参考，由两名经验丰富的病理学家和一名皮肤病学家共同评估和定义组织区室。FTIR光谱成像在透射模式下使用配备64×64碲镉汞焦平面阵列检测器的Bruker Vertex 70光谱仪和Hyperion 3000红外显微镜完成，光谱范围3800–900 cm?1，光谱分辨率8 cm?1，像素投影采样约2.7×2.7 μm2。光谱预处理包括去除1796.5–2789.1 cm?1区间、橡胶带基线校正和向量归一化。研究采用单变量化学图谱、均值光谱分析、主成分分析和基于CytoSpec的无监督聚类（包括k均值聚类、模糊c均值聚类和层次聚类分析）进行数据解析。此外，研究人员尝试从FFPE组织中提取DNA并扩增内转录间隔区2（ITS2）区域进行分子物种鉴定，但未获得足够质量的序列数据，因此分子结果未用于病例分类或ROI定义。
**三、主要研究结果**
**3.1 真菌感染相关组织区室的组织学引导鉴定**
组织学评估作为ROI定义和FTIR模式生物学解释的参考。HE染色提供总体组织架构，PAS和GMS染色显示角化或滤泡区室内的真菌结构。代表性连续切片显示真菌成分位于浅表角化组织或毛囊/漏斗部结构内，强调区分真菌感染相关区域与非感染角化组织的必要性。
**3.2 FTIR化学图谱揭示空间连贯的感染相关模式**
单变量FTIR化学图谱显示，在900–1300 cm?1指纹区内，特别是在900–1120 cm?1、约1185 cm?1和约1240 cm?1区域，真菌感染相关区域、角化组织和活性表皮之间存在显著空间对比。该指纹区包含碳水化合物、蛋白质、核酸和含磷酸盐生物分子的重叠光谱贡献。相比之下，以Amide I（1620–1680 cm?1）和Amide II（约1500–1580 cm?1）以及C–H伸缩振动（2800–3000 cm?1）为主的图谱主要反映蛋白质和角化相关组织形态学，被解释为互补的组织对比标记而非真菌特异性图谱。
**3.3 真菌感染相关区域、角化病和活性表皮之间的光谱差异**
类平均光谱分析显示三个组织类别在指纹区约1030、1085、1185和1240 cm?1处存在明显的描述性差异。角化病与真菌感染相关区域表现出部分重叠的光谱特征，与真菌成分位于角化组织内或邻近的组织学定位一致。定量病例水平分析显示，在包含全部三种组织区室的10例病例中，约1030、1085、1185和1240 cm?1处的总体比较均显著（Friedman检验，FDR校正后q值均<0.05）。在真菌感染相关组织与活性表皮的配对比较中（n=12），约1185 cm?1（q=0.00110）和1240 cm?1（q=0.00110）处差异显著。真菌感染相关组织与角化病在四个指纹区波段均存在显著差异，而角化病与活性表皮在所有四个波段也均存在显著差异。
**3.4 组织学定义组织区室的病例水平主成分分析**
病例水平PCA显示生物学聚合后组织相关光谱结构仍然存在。在900–1800 cm?1指纹区，PC1和PC2分别解释83.2%和8.6%的总方差（累积91.8%）。活性表皮病例水平光谱分布相对紧凑，而真菌感染相关和角化病光谱分布较宽且部分重叠。载荷谱显示方差分布在多个光谱区域而非单一波数决定。联合900–1800 cm?1和2800–3000 cm?1区域的分析显示PC1和PC2分别解释74.7%和13.2%的方差，总体分布与指纹区PCA相似。
**3.5 FTIR图像的无监督聚类分析**
使用900–1680 cm?1、1690–1770 cm?1和2800–3000 cm?1光谱范围进行的无监督聚类（KMC、FCM和HCA）在代表性组织切片中分离出与形态学可识别区室相对应的空间连贯光谱域，包括角化物质、活性表皮或滤泡结构、间质组织和管腔/背景区域。在真菌阳性滤泡病变中，聚类图谱将滤泡内内容物与周围滤泡壁或滤泡周围上皮边缘及邻近间质组织分开。在评估的6、7和8类解决方案中，七类KMC和FCM解在区室分离和空间连贯性之间提供了最具可解释性的平衡。
**四、讨论与结论**
本研究表明FTIR化学成像能够在人类皮肤组织切片中揭示与真菌感染相关的空间连贯生化模式。最显著的光谱差异一致出现在900–1300 cm?1指纹区，尤其是约1085、1185和1240 cm?1处。然而，真菌感染相关ROI并不代表分离的真菌生物量，而是包含真菌结构、角蛋白、上皮成分和局部感染相关微环境的组合贡献。因此，观察到的光谱特征应被解释为组织学确认的真菌感染相关组织区室的生化特征，而非真菌特异性诊断生物标志物。
将角化病作为独立比较类别是本研究的核心方法学要素之一。定量分析显示角化病在指纹区各波段与真菌感染相关组织和活性表皮均存在显著差异，表明观察到的光谱对比不能仅归因于真菌物质的存在，而是反映了更广泛的组织学定义区室的生化组成，包括角蛋白相关贡献。与之前应用FTIR显微镜研究疥疮的概念验证研究相比——该研究在约1072 cm?1处检测到几丁质丰富的外骨骼的显著光谱对比——真菌感染涉及更复杂的组织区室问题，真菌成分常嵌入角化组织且可能接近FTIR成像的有效空间分辨率，无法以同等程度实现空间分离。
本研究的局限性包括：样本量有限、缺乏独立非感染对照组、FTIR图像与染色切片间精确像素级配准的技术挑战、分子物种鉴定未能成功完成、以及真菌与周围组织的光谱贡献无法完全分离。未来研究应扩大病例数、纳入明确菌种、采用更精确的图像配准和优化的分子鉴定方案，并使用严格的病例级验证策略（如留一病例交叉验证）进行评估。
结论：本研究证明FTIR化学成像能够为人类皮肤中组织学定义的真菌感染相关组织区室提供无标记、空间分辨的生化信息。最强的光谱对比出现在900–1300 cm?1指纹区，尤其以约1085、1185和1240 cm?1处为著，其中真菌感染相关组织与活性表皮之间的病例水平统计差异在约1185和1240 cm?1处最为明确。由于真菌成分嵌入在角化和上皮组织内或邻近处，这些光谱特征不能完全归因于真菌物质，应被解释为探索性的感染相关组织特征。HE、PAS和GMS组织学相关性对于生物学解释仍然至关重要。总体而言，FTIR化学成像可能通过提供额外的分子对比来补充常规皮肤病理学，但在考虑诊断应用之前，需要对监督分类模型进行更大规模的独立病例级验证研究。
