利用LMO和BD Rhapsody转录组学技术，对同型半胱氨酸在鸟类胚胎发生过程中引起的扰动进行单细胞分析

《iScience》：Single-cell mapping of homocysteine-induced perturbations in avian embryogenesis using LMO and BD rhapsody transcriptomics

　　**亮点：**
- LMO多重标记技术支持在BD Rhapsody平台上对鸡胚胎进行单细胞RNA测序（scRNA-seq）。
- 非整合分析技术能够保留敏感的转录特征。
- 同型半胱氨酸会改变由NMP衍生的中胚层程序和轴向延长过程。
- 该工作流程有助于在发育模型中检测微妙的处理效果。

## 摘要
单细胞RNA测序技术能够研究细胞异质性以及环境干扰对复杂组织的影响。然而，微妙的生物学响应可能被实验噪声、样本特异性处理和计算整合所掩盖。在这里，我们将脂质修饰寡核苷酸细胞标记技术与BD Rhapsody平台结合，用于对暴露于不同同型半胱氨酸条件下的早期胚胎细胞进行多重标记。这种不受物种限制的方法实现了可靠的样本条形码化、同时处理多种处理条件，并从异质性胚胎尾部组织中恢复高质量的单细胞转录组。通过比较非整合和整合分析，我们发现整合分析虽然保留了广泛的细胞身份信息，但可能掩盖了敏感细胞群体的特异性转录特征。利用非整合的多重数据集，我们发现了与同型半胱氨酸相关的神经中胚层前体细胞的转录变化，并将其与后续中胚层发育和轴向延长缺陷联系起来。这种工作流程为在非传统发育模型中检测微妙处理效果提供了灵活的策略。

## 引言
单细胞RNA测序（scRNA-seq）已成为在单细胞水平上探索人类和模式生物体生物学异质性的强大工具。最近在scRNA-seq领域的进展使得可以通过多重标记策略将多个样本的细胞整合到单一文库中，从而提高样本通量，同时最小化技术批次效应、文库制备时间和总体成本。这些策略允许在遗传或环境干扰条件下直接比较不同样本，同时减少生物信息学处理的复杂性。样本多重标记通常通过利用已有的基因多样性或在合并样本前引入样本特异性条形码来实现，这一过程通常被称为“哈希”（hashing）。已经开发了几种实现这一目的的方法，包括寡核苷酸标记抗体、化学寡核苷酸标记以及基于脂质的寡核苷酸哈希，后者可以通过单组分胆固醇修饰寡核苷酸（CMOs）或作为两组分锚/辅锚系统的脂质修饰寡核苷酸（LMOs）来实施。然而，大多数这些方法主要在人类和小鼠系统中进行了优化和验证，限制了它们在非传统或胚胎模型生物体中的直接应用。

CMOs和LMOs哈希的缺点之一是在单细胞封装之前引入了额外的处理步骤，这可能直接影响细胞存活率，进而影响分析质量。为缓解这一影响，MULTI-seq LMO设计增加了整体疏水性，并改善了标记复合物在洗涤和处理过程中的膜保持能力，尤其是在细胞数量少或细胞结构复杂的样本中（如体内胚胎动物组织）。迄今为止，尚未有研究验证LMO标记技术在鸡模型中的效率，尤其是在脆弱的、高度异质性的早期胚胎细胞中的效果。在这里，我们生成了一种荧光LMO探针，以评估这种标记策略针对分离的鸡胚胎细胞的能力，并验证处理后的细胞存活率以及不同细胞和组织类型的标记均匀性。在此研究中，样本多重标记仅使用MULTI-seq LMO的木脂酰胺修饰锚和棕榈酰胺修饰辅锚进行。

BD Rhapsody单细胞RNA测序平台在处理高细胞异质性和高RNA含量的样本方面具有显著优势，能够从体内动物组织中生成可靠的高质量数据。与其他平台（如10× Genomics Chromium）相比，BD Rhapsody在处理小尺寸细胞时表现出更优异的性能，特别适合用于细胞尺寸减小的发育研究。目前，该平台最常用的多重标记策略依赖于使用物种特异性泛细胞抗体的抗体标记，每次实验可分析多达40,000个细胞。然而，这种方法存在重要限制：抗体标记依赖于表位识别，可能无法捕捉样本内的全部细胞多样性。这些限制增加了错过细胞群体的风险，尤其是考虑到现有试剂主要限于人类和小鼠样本。到目前为止，还没有适用于鸡样本的多重标记策略，这突显了在该模型中进行单细胞研究的方法学空白。通过利用LMO基多重标记技术（可针对所有动物物种和细胞类型），我们可以克服依赖抗体的方法的局限性，并在不同环境条件下对胚胎样本进行多重标记。除了每次实验可分析多达40,000个细胞外，BD Rhapsody基于微孔的单细胞RNA测序方法还能从起始细胞存活率仅为50%的悬浮液中生成高质量数据，部分得益于加载后洗涤步骤，该步骤可以清除培养基中的死细胞和环境RNA。

在这项研究中，我们首先在异质性的鸡胚胎组织中验证了LMO标记的效果，然后利用该策略在BD Rhapsody平台上对这些样本进行了多重标记。由于LMO标记在捕获前引入了额外的样本处理步骤，这种工作流程可能会导致不同处理条件之间的技术差异，从而引发是否需要数据整合以适当比较用这种方法生成的多重样本的问题。尽管最近有类似LMO基策略被用于小鼠肿瘤细胞的单细胞捕获，但其在不同环境条件下应用于早期鸡胚胎细胞的情况尚未报道。此外，由于在这种实验背景下整合与非整合分析之间的直接比较仍然有限，因此尚不清楚在鸡胚胎样本中将LMO多重标记与BD Rhapsody结合使用时整合方法的适用程度如何。鸡模型是发育和生物医学研究的优秀模型，不仅用于临床评估小分子的致畸性，还被认为是分析细胞对多种治疗/化学物质反应的合适模型。由于其易于获取，它已成为研究发育过程中环境干扰作用的理想模型，例如胚泡形成和身体轴形成等发育程序。 maternal高同型半胱氨酸血症越来越多地被认为是一种与不良妊娠结局和胎儿发育改变相关的环境和代谢干扰因素，包括神经管缺陷、胎盘功能障碍和胎儿生长受限。然而，在哺乳动物系统中模拟这种类型的发育干扰具有挑战性，因为母体生理、胎盘转运和胚胎暴露紧密相关。在这项工作中，我们使用鸡胚胎作为实验模型，可在无需母体干预的情况下直接持续提高同型半胱氨酸水平，从而评估其对后续身体轴延长的影响。先前的研究表明，向禽类胚胎添加同型半胱氨酸会诱导类似神经管的缺陷，表明神经管形态发生过程受损。然而，它如何影响胚胎发生过程中的相关发育程序和细胞状态尚不完全清楚。在这里，我们决定结合靶向同型半胱氨酸处理与多重单细胞RNA测序，以识别同型半胱氨酸处理对参与后续身体轴形成的细胞转录状态的影响。

在我们的研究中，我们结合了LMOs的泛细胞标记优势和仅分析存活细胞的优势，实现了在不同处理条件下对脊椎动物胚胎样本进行高质量单细胞RNA测序，每次实验最多可分析40,000个活细胞。

**结果**
- 无毒剂量的同型半胱氨酸处理会在Gallus gallus胚胎中引起后续轴缺陷。
在这项研究中，我们选择了接近人类生理相关且升高的同型半胱氨酸（HCys）暴露范围。在人类血浆中，总同型半胱氨酸通常认为在约15 μM以下的正常范围内，而更高浓度则与高同型半胱氨酸血症和疾病状态相关。因此，我们将20 μL浓度为0.5 mM和19 mM的HCys注射到卵黄中，最终得到0.5 μM（低剂量，LD）和19 μM（高剂量，HD）的HCys处理剂量（图1A）。值得注意的是，此处使用的HD剂量远低于之前报道的在禽类胚胎中的致畸剂量，其中200 mM D,L-同型半胱氨酸处理会导致血清同型半胱氨酸浓度超过150 μM。HCys处理后，与对照组相比，处理过的胚胎尾部区域出现了可见的退化现象。偶尔也观察到心脏和前神经管的缺陷（数据未显示）。这些结果与人类胚胎中的先前知识一致，表明NTD表型与高HCys水平之间存在相关性。在鸡和小鼠胚胎中，已经证明HCys处理可以诱导类似神经管缺陷（NTD）的表型。

**图1** 用脂质修饰寡核苷酸（LMO）标记胚胎鸡细胞
- （A）示意图显示了用不同浓度同型半胱氨酸处理的鸡胚胎，并在72小时后进行孵育（左）。示意图显示了用LMO（锚和辅锚）标记的离散细胞，并用荧光探针（Atto550染料）进行荧光检测（右）。
- （B）直方图显示了用20 nM和200 nM LMO标记的单细胞群体在BD FACS Melody上的分析结果。
- （C）密度图显示了基于FVS 660和Atto 550强度在BD FACS Melody上测量的活细胞和死细胞中LMO标记细胞的分布。大约15%的细胞死亡（右上），79%的细胞存活且被LMO标记（右下），4.8%的细胞存活但未被标记（左下）。
- （D）代表性共聚焦图像显示了用LMOs（Atto550阳性）标记的活细胞（Hoechst阳性），在Zeiss LSM 980上以20倍放大率获取。比例尺，20 μm。

**脂质修饰寡核苷酸均匀标记存活的鸡胚胎细胞**
脂质修饰寡核苷酸（LMOs）提供了一种适用于多种细胞类型或细胞核的多功能样本条形码化解决方案。它们的疏水末端可以插入可访问的质膜中，便于从不同处理条件下合并单细胞样本进行处理。这些脂质修饰寡核苷酸由木脂酰胺修饰的锚DNA寡核otide和棕榈酰胺修饰的辅锚DNA寡核otide组成，它们可以无缝嵌入细胞或细胞核膜中，在“手柄”区域提供互补的5′序列供DNA条形码附着。为了评估LMO在鸡细胞膜中的插入情况，我们设计了一种荧光探针，该探针能够与锚的3′末端“手柄”区域杂交，该区域特别用Atto550标记（图1A，右）。使用活力染料（FVS 660 BD Biosciences），我们首先通过流式细胞术区分活细胞和死细胞。然后加入LMO标记的负对照（仅探针），以确定荧光信号的特异性，并基于背景/非特异性Atto550信号建立LMO阳性细胞的筛选标准（图S1A）。这种策略使我们能够区分LMO标记细胞和未标记细胞，同时排除死细胞和背景荧光。接着使用BD FACS Melody通过流式细胞术分析插入效率。我们测试了三种最终LMO浓度（2 nM、20 nM和200 nM）对分离细胞的标记效果（表S1）。在制造商推荐的200 nM浓度下，观察到更均匀的标记效果（图1B）。较低浓度表现出双相行为，既有高度标记的细胞也有弱标记的细胞（图1B）。使用制造商推荐的200 nM浓度时，79%的活细胞被LMO标记，死亡率为15%（图1C和1D）。总体而言，LMO是一种有效的标记异质性鸡胚胎细胞的方法。

**LMO基多重标记技术在BD Rhapsody工作流程中的应用**
为了标记特定样本中的每个细胞，合成了一种具有独特8核苷酸条形码的唯一样本条形码（SBC）。这些序列包含与锚的“手柄”区域互补的5′区域，后面跟着经过验证的条形码序列和3′ polyA尾，用于连接Rhapsody珠子（表S2）。为了对鸡胚胎细胞进行LMO标记，首先将细胞分离并按样本分别用锚-辅锚和SBC混合物进行标记（见STAR方法）。在冰上孵育后，通过离心步骤（两次）去除多余的LMOs。在评估LMO标记后的最终细胞存活率后，将每个样本的13,000个存活细胞加载到 cartridge中。细胞捕获步骤遵循BD Rhapsody协议和文库制备步骤进行（图2）。

**图2** 使用Rhapsody Cartridge从单细胞来源的鸡胚胎组织中捕获mRNA和LMO的步骤
- （A）图示说明了BD Rhapsody系统中细胞捕获的主要步骤。与标准捕获方法不同，样本条形码构建（SBC）包含一个polyA区域，使标识符能够在细胞裂解后与珠子杂交。这一特性确保了在纯化和逆转录步骤中的扩增过程中其保留性，从而实现了有效的捕获和下游分析。(B) 通过在裂解后的上清液中采用PCR技术扩增LMO文库，使得可以对条形码区域进行扩增和测序，以便确定细胞身份。自定义引物列在表S3中。(C) 如BD Rhapsody协议所述，需要通过对纯化的珠子进行PCR来扩增mRNA文库，以制备全转录组文库。改进的BD AbSeq协议可以从单个细胞中通过polyA/polyT相互作用回收LMO衍生的样本条形码mRNAs和LMOs（图2A）。珠子携带的细胞条形码能够将mRNA转录本分配到单个细胞，而LMO衍生的样本条形码则可以将每个细胞与其原始生物样本关联起来。在珠子上捕获mRNAs和LMOs后，按照既定的BD协议进行逆转录和外切酶处理。珠子的上清液被单独保存和处理，以生成特定于LMOs的文库，从而实现对细胞的条形码化（图2B和STAR方法）。在这里，我们使用了一种名为Multi Seq Primer的特定引物进行PCR1步骤，该引物与“Handle”区域互补，并包含允许Primer PCR2结合的互补区域（表S3）。同时，使用装载有cDNA的珠子生成转录组文库（图2C）。这个过程包括随机引物扩增和延伸，随后进行两个PCR步骤。为了对这两个文库进行测序，我们在高通量Illumina平台上进行了配对末端150 bp测序。LMO文库的测序深度为每个细胞2000次读数，全转录组分析文库的测序深度为每个细胞50,000次读数。BD Rhapsody分析成功检索了转录组和LMO条形码文库。BD Rhapsody提供了一个在线平台，即“Seven Bridges”，带有内置的分析流程，允许用户检查测序质量、对齐和注释读取结果，并生成下游分析所需的输出文件。我们调整了VDJ功能对齐，以在BD Rhapsody WTA分析流程中检索LMO序列。为此，我们提供了来自WTA和LMO测序的FASTQ文件、参考基因组、转录组注释以及作为补充参考文件的条形码序列。输出文件包括过滤或未过滤的表达矩阵、BAM文件，以及一个指示测序和质量对齐情况的流程报告（Data S1）。对齐的质量控制表明mRNAs和LMOs都得到了成功的扩增。具体来说，96.41%的读取数据通过了质量过滤器，其中75.6%的细胞读取数据对于mRNA是唯一对齐的，而97.16%的读取数据对于LMOs是唯一对齐的（Data S1）。t-SNE图（图S1B，上方）显示了三个样本结合后的WTA文库的基因集总和，共检测到28,146个基因。每个样本的条形码表达水平也得到了良好的检索，分布大致呈单峰且对称，大多数细胞显示大约100个条形码计数（对数转换值约为2；图S1B，下方）。这种模式支持样本的相对均匀混合，并表明LMO衍生的条形码以及预期的mRNA转录本被正确检索。LMO解复用技术可以识别高质量的单一条形码鸡胚胎细胞。为了分析数据，我们使用了已发布的Seurat流程进行数据解复用、正确的LMO身份分配和质量控制。应用严格的过滤标准（每个细胞超过100个条形码），我们共检索到了16,385个用于分析的单个条形码细胞（图S1E）。图S1C展示了QC过滤前后nFeature_RNA、nCount_RNA和percent.nt的小提琴图。为了进一步去除潜在的人工伪影，我们通过计算方法识别出了重复样本，在图S1D中显示了它们的分布，其中重复样本在UMAP投影中用红色标出，单个样本用灰色标出。高质量细胞被定义为那些线粒体基因含量少于25%且表达1,000到10,000个基因的细胞。过滤后，我们保留了9,231个高质量的单个条形码细胞用于下游分析（图S1E）。整合策略保留了广泛的细胞身份，但改变了敏感的尾部形成细胞群体。在单细胞RNA测序实验中，技术噪声可能出现在多个阶段，包括细胞解离、处理和文库制备过程中，其中细胞压力、RNA捕获效率或逆转录的差异可能会引入与生物学无关的变异性。额外的处理步骤，如洗涤、标记或多路复用，可能会进一步影响细胞回收和转录本检测，从而导致批次特异性偏差。这些变异来源可能会影响聚类和基因表达模式，因此在比较样本时仔细的标准化和整合非常重要。虽然此处我们使用了同时封装和测序的步骤，但技术噪声仍可能存在并影响生物学结果的解释。为了评估计算整合如何影响尾部形成细胞群体的识别，我们首先建立了一个非整合的基线数据集（图3A左侧），并根据具有高调整显著性の正差异表达基因（DEGs）分配了簇身份，并使用GEISHA数据库进行了验证（图3A右侧；图S2）以及我们对该解剖区域现有细胞状态的先前了解。这个基线作为参考，用于比较不同整合策略对簇结构和生物学身份的影响。图3 基线聚类和尾部形成细胞群体整合策略的评估。图查看器(A) 非整合基线数据集的UMAP，显示（左侧）每个样本的细胞分布（SBC1：对照组；SBC3：低剂量HCys；SBC7：高剂量HCys）以及分配给尾部形成细胞群体的簇（右侧）。细胞身份使用GEISHA数据库中的验证标记基因进行了注释。(B) RPCA和Harmony整合数据集的UMAP，包括默认设置（rpca_main）和两种额外的参数化设置（s1和s2）。簇颜色与相应的基线群体相匹配。对于每个整合簇，通过与基线共享的正差异表达基因（DEGs）的百分比来评估相似性，使用按调整后的p值排序的前200个正DEGs进行计算。(C) 基线数据集和三种RPCA整合条件（rpca_main、rpca_s1和rpca_s2）中每个簇识别的正DEGs数量。(D) 对应于基线簇5的晚期神经管群体的参考基因，以及NOTCH2和ROBO1的GEISHA原位杂交图像，支持将该簇注释为晚期神经管。然后，我们使用两种常用的方法RPCA和Harmony生成了整合数据集，每种方法都在默认配置和两种额外参数化设置下进行了测试（图3B）。对于RPCA，我们改变了整合特征的数量（nfeatures）和锚点过滤的严格程度（k.filter），同时保持锚点检测不变（k.anchor = 5）。具体来说，nfeatures控制用于定义整合空间的变量基因的数量，而k.filter决定了在整合过程中移除低置信度锚点的严格程度；较高值使得锚点过滤更为宽松，而较低值则应用更严格的过滤。我们还调整了k.weight，它控制在生成整合嵌入时有多少锚点参与加权步骤。使用这个框架，我们测试了三种RPCA设置：rpca_main（nfeatures = 2000, k.anchor = 5, k.filter = 50, k.weight = 25），rpca_s1（nfeatures = 1800, k.anchor = 5, k.filter = 40, k.weight = 20），以及rpca_s2（nfeatures = 2500, k.anchor = 5, k.filter = 100, k.weight = 50）。对于Harmony，我们改变了控制批量校正强度和结构的参数。特别是theta是多样性惩罚项，它决定了Harmony在不同样本细胞之间混合的强度；较大的值促进了更强的混合。lambda是校正的激进程度，较小的值导致更强的校正。Sigma定义了软k-means聚类的宽度，nclust设置了Harmony模型内部使用的簇数量。在我们的分析中，我们保持theta、sigma和nclust不变，改变了theta以测试不同的校正强度：harmony_main（theta = 2, lambda = 1, sigma = 0.1, nclust = 50），harmony_s1（theta = 1, lambda = 1, sigma = 0.1, nclust = 50），以及harmony_s2（theta = 3, lambda = 1, sigma = 0.1, nclust = 50）。整合UMAP中的簇颜色与相应的基线群体相匹配，对于每个整合簇，我们使用按调整后的p值排序的前200个正DEGs来量化与基线的相似性。总体而言，两种整合方法都保留了数据集的整体结构，但对于特定群体出现了重要差异。特别是，Harmony在这种聚类分辨率下无法分辨神经中胚层前体（NMP）群体，而RPCA仅在主设置和s1设置中检测到了NMPs。这表明保留生物学相关群体的能力取决于整合方法和参数选择。基于共享DEGs的更详细比较显示，大多数RPCA整合数据集中的簇与基线有很高的重叠，支持了簇身份的广泛保守性（图3B）。然而，一个显著的例外是晚期神经管群体，对应于基线簇5（深红色），在rpca_main和rpca_s1中与其相应的整合簇没有共享DEGs（浅红色）。与此观察一致的是，每个簇中识别的正DEGs数量显示，整合RPCA数据集中的簇2包含的正DEGs少于10个，而大多数其他簇的DEGs数量与非整合基线相当（图3C）。因此，整合对这个特定群体的影响尤为显著。重要的是，整合后晚期神经管簇中DEGs的明显丢失并没有反映出生物身份的完全丧失。当我们检查在GEISHA中验证的晚期神经管参考基因的表达情况时，包括NOTCH2和ROBO1，相应的整合簇仍然保留了这一群体的预期生物学特征（图3D）。这表明整合，特别是在这里测试的RPCA设置中，可能会过度校正某些簇，使它们在转录上更类似于相邻群体，从而掩盖了簇特定的DEGs，而没有完全抹去它们的潜在身份。这些结果表明，整合对某些细胞群体的影响比对其他群体更强。在我们的数据集中，非整合的BD Rhapsody基线对于保持敏感群体的转录组独特性至关重要，例如晚期神经管簇。这对于跨处理的下游比较特别相关，因为对特定簇的过度校正可能会掩盖在非整合分析中仍可检测到的生物学意义上的基因表达变化。由于多路复用数据集包含的技术变异有限，整合过程中引入的任何校正更直接反映了参数驱动的效果，使得它们成为在选择最小化转录扭曲的设置时的理想框架。同型半胱氨酸处理诱导了NMP衍生群体中的亚簇特异性转录变化。为了进一步评估同型半胱氨酸处理是否改变了主要尾部细胞群体的表达，我们首先使用非整合、RPCA和Harmony整合数据集比较了每个簇中细胞的相对贡献（图S3）。总体而言，几个群体在对照组和处理组中的分布相似，表明处理并未全局重塑所有胚胎细胞的身份。例如，侧板中胚层在不同条件下的比例表示没有明显变化，而血细胞在两个处理组中都一致增加。此外，与神经组织相关的群体在处理后没有显示出主要的变化，而NMPs和侧板中胚层簇之间的差异是可见的。这些结果表明，在广泛的簇注释层面，同型半胱氨酸处理并没有均匀改变所有尾部群体的组成。然而，由于这种级别的簇分配捕获了每个群体的全局转录特征，发育动态前体组分内的微妙治疗相关变化可能仍未解决。因此，我们专注于与NTD样表型相关的尾部组织相关的簇，即神经中胚层前体（NMP）、侧板中胚层和早期神经管簇。由于NMPs是具有分化为中胚层或神经组织潜力的双能细胞，它们比例和转录特征的变化可能会影响这些组织的正常发育。为了确定治疗是否改变了这种发育连续体中的转录状态，我们将这三个群体重新聚类（图4A，上部）。图4展示了在尾部形成过程中同型半胱氨酸处理对亚群分析和形态学的影响。图4A显示，根据SBC1（对照组）、SBC3（低剂量HCys）和SBC7（高剂量HCys）的UMAPs对细胞进行分割后，NMP、旁轴中胚层和早期神经管群体被划分为五个簇（上部）。通过检测标记基因TBXT和SOX2（用于NMP）、MEOX1（用于旁轴中胚层）和PAX6（用于早期神经管）的表达，可以确定这些亚群的假定身份。（B）上部：每个亚群中治疗诱导的差异表达基因（DEGs）的数量与对照组相比进行了归一化。下部：每个亚群中治疗诱导的DEGs的数量按簇大小进行了归一化。低剂量 vs 基线（金色）；高剂量 vs 基线（红色）。（C）显示了对照组、低剂量HCys和高剂量HCys处理下的胚胎的代表性图像，包括背视图和腹视图。虚线框表示解剖区域。刻度尺为200毫米。（D）按条件对胚胎大小进行了全局测量，包括总胚胎大小、前部大小（从血管分支到鼻子的距离）和后部大小（从血管分支到尾部末端的距离）。n = 27。统计显著性使用双尾t检验进行评估。后部大小：对照组 vs LD p = 0.0428；对照组 vs HD p = 0.0160。（E）每种条件下的尾部末端代表性图像，用TBXT（绿色）和SOX2（紫色）进行免疫染色。SOX2标记早期神经组织（NT），双阳性细胞对应于NMPs，TBXT标记中胚层组织。使用DAPI通道，最后一个形成的体节（LSOM）被标记为中胚层命运的标志。刻度尺为200微米。（F）量化显示了治疗对平均LSOM宽度和平均LSOM长度的影响。n = 27。统计显著性使用双尾t检验进行评估。宽度：对照组 vs LD p = 0.0059；对照组 vs HD p = 0.0157。长度：对照组 vs LD p = 0.0239。（G）量化了LSOM与尾部末端之间的距离，包括平均PSM宽度、后部NT的平均宽度、前部NT的平均宽度以及NT到尾部末端的距离。n = 27。统计显著性使用双尾t检验进行评估。LSOM-END：对照组 vs LD p < 0.0001；对照组 vs HD p = 0.0020。这种亚群分析确定了五个亚群，其假定身份通过NMP和谱系committed的典型标记来分配。TBXT和SOX2的表达用于识别NMP样状态，MEOX1用于识别晚期旁轴中胚层，PAX6用于识别早期神经细胞（图4A）。根据这些标记，簇2对应于纯NMPs群体，而簇1的一部分代表神经细胞，簇4代表旁轴中胚层（MSGN1阳性），簇0代表体节身份。相比之下，簇3在治疗后的胚胎中过度表达，具有神经细胞、NMPs和旁轴中胚层的标记，表明这些细胞身份在处理后的胚胎中具有特定的转录状态。接下来，我们通过量化低剂量组与对照组以及高剂量组之间的显著差异表达基因（DEGs）的数量来检查每个亚群内的治疗诱导的转录反应（图4B，上部）。分析显示，低剂量治疗减少了由神经细胞和NMP样细胞组成的簇1中的DEGs数量，而高剂量治疗则与更多中胚层亚群中的DEGs数量增加相关。由于较大的簇可能天然产生更多的DEGs数量，我们随后按簇大小对DEG计数进行了归一化（图4B，下部）。归一化后，两种处理在大多数亚群中显示出大致相似的效果。重要的是，簇3（HCys-NMPs）、簇1（神经）和簇4（旁轴中胚层）在治疗组与对照组之间显示出强烈的DEG差异，表明尽管这些细胞保持了它们的标记基因和细胞身份，但HCys治疗仍可诱导一些转录变化。这些结果共同表明，同型半胱氨酸治疗以特定于亚群的方式影响NMP相关群体的转录输出。同型半胱氨酸优先干扰后部中胚层的输出和轴延长。为了验证这些转录变化是否与形态缺陷相关，我们随后检查了治疗对胚胎形态的影响（图4C–4G）。图4C展示了对照组、低剂量HCys和高剂量HCys胚胎的代表性背视图和腹视图，虚线框表示尾部末端区域。全局形态测量证实治疗效果是区域特异性的：尽管总体胚胎大小和前部大小没有显著变化，但后部大小在低剂量和高剂量处理下均显著减小（图4D）。这些数据支持同型半胱氨酸优先影响后轴发育的观点。为了更详细地研究这一表型，我们通过针对TBXT和SOX2进行免疫染色来分析尾部区域（图4E）。在这个背景下，SOX2标记早期神经组织，TBXT标记中胚层组织，双阳性细胞对应于NMPs。使用DAPI通道，我们将最后一个形成的体节（LSOM）标记为中胚层分化的标志。这些图像的量化显示，在两种处理条件下LSOM宽度显著减小，而LSOM长度仅在中剂量HCys处理下显著减小（图4F）。这些观察结果表明，在HCys处理的胚胎中体节形状存在显著变化，这与单细胞RNA测序显示的中胚层谱系变化一致。这表明同型半胱氨酸可能影响前体向中胚层衍生物的转变，因为LSOM代表这一谱系的中间产物。与这一解释一致，对尾部区域的测量进一步显示，在处理后的胚胎中LSOM与尾部末端之间的距离显著减小（图4G），表明参与后身体轴延长的细胞池减少。相比之下，PSM的平均宽度、面向最后一个形成的体节的前部神经管或神经管到尾部末端的距离没有显著变化。这种神经维度的相对保留与图S3中显示的比例分析以及广泛神经群体中没有主要治疗相关变化的结果一致，支持同型半胱氨酸主要影响后部中胚层输出和轴延长的结论。总体而言，据我们所知，这是首次在鸡胚胎细胞中使用BD Rhapsody与基于LMO的多路复用技术进行单细胞RNA测序的应用。我们展示了这种策略能够实现强大的样本条形码编码、高效恢复高质量的单个细胞，并可靠地识别高度异质性和分离敏感组织中的胚胎尾部形成群体。通过系统地比较非整合和整合分析，我们进一步证明了计算整合可能会不成比例地影响特定的细胞群体，在某些情况下掩盖了特定于簇的转录特征，同时保留了更广泛的细胞身份。利用这一框架，我们发现同型半胱氨酸处理优先干扰后部中胚层的输出和身体轴的延长，同时对广泛神经群体的比例影响较小。这些发现不仅为鸡模型提供了实用的多路复用工作流程，还突显了非整合多路复用单细胞分析在检测可能在标准整合流程中被掩盖的生物学上有意义的转录变化方面的价值。

讨论
单细胞RNA测序（scRNA-seq）彻底改变了细胞异质性的研究，提供了对复杂生物系统的无与伦比的见解。然而，不同的多路复用策略对数据质量、可扩展性和跨物种的应用性有着深远的影响。到目前为止，大多数经过验证的协议依赖于基于抗体的标记方法，例如TotalSeq HashTag抗体，这些方法仅限于人类和小鼠系统。相比之下，我们的研究表明，脂质修饰寡核苷酸（LMOs）是一种通用且不受物种限制的标记方法，可以轻松与BD Rhapsody微孔平台结合使用。这种组合使得在早期发育阶段对鸡胚胎细胞进行强大的多路复用成为可能，从而解决了评估环境干扰对分离敏感和异质性胚胎组织影响的关键挑战。与基于抗体的方法相比，LMO标记有几个优势。首先，它独立于表位识别，避免了由于抗体可用性有限或细胞表面标记暴露不均可能导致的偏差，从而可以覆盖高度异质的早期胚胎组织。其次，LMO标记与BD Rhapsody的清洗步骤相结合，确保只有存活的细胞能够参与下游分析，有效减少了来自环境RNA的背景信号。在推荐的200 nM LMO标签浓度下，我们实现了约80%存活细胞的均匀标记，同时保持了每个试剂盒最多40,000个细胞的可扩展性。通过仅保留条形码计数高于100的细胞，我们获得了16,000个细胞用于下游分析。我们的测序深度——LMO文库每个细胞2,000个读数，转录组文库每个细胞50,000个读数——达到了或超过了多路复用工作流程的行业标准。这些结果与其在PBMCs和细胞系上的先前的使用一致，表明LMO标记在优化后能够实现高信噪比。重要的是，使用LMO多路复用结合BD Rhapsody获取的所有细胞状态之前也可以通过不使用多路复用结合indrop单细胞测序获得，尽管测序深度更深，且使用这项新技术恢复的基因更多。LMOs也已在其他脊椎动物模型中成功应用，包括斑马鱼大脑发育的研究，支持其在不同物种中的广泛应用。在鸟类模型中，MULTI-seq最近被用于使用10× Genomics平台研究后期胚胎阶段的肠道发育。我们的工作通过提供LMO在鸡胚胎细胞中的插入证明，以及直接测试LMO在活细胞中有效插入的适配器，扩展了这些发现。这不仅为早期鸡胚胎的多路复用scRNA-seq建立了一个经过验证的工作流程——这是身体轴形成的一个关键窗口，其中包含高度异质性的群体，此前尚未得到解决——而且还首次提供了使用BD Rhapsody平台对胚胎细胞进行LMO条形码编码的可重复流程。这种新颖的组合为分离敏感的胚胎组织提供了一种强大且可扩展的方法，扩展了LMOs和BD Rhapsody在人类和小鼠系统之外的应用范围。

scRNA-seq的一个核心挑战是区分真正的生物变异和技术噪声。在比较不同类型的数据时，通常使用批量校正算法来减少技术伪影。然而，这些算法有时可能会过度校正，从而去除真实的生物信息。过度校正会使下游分析变得复杂，并且经常导致错误的结论。在我们的研究中，LMO条形码编码从一开始就允许我们将细胞区分开来，从而减少了技术变异性，并消除了计算批量校正的需要。这种方法确保了精确的样本识别和全面的转录组分析。实际上，我们在分析中发现所有细胞在UMAP图中的位置相似，没有任何批量效应校正。更重要的是，当使用批量效应校正算法时，一些细胞类型被合并了，处理后的微妙变化被隐藏了。这表明我们的多路复用策略提供了显著的优势，保留了微妙的转录组变化，例如那些可能被计算整合校正掉的由环境处理引起的变化，从而实现了更准确的生物学解释。从生物学角度来看，我们的结果提供了一个新的模型系统，用于研究升高的同型半胱氨酸对鸡胚胎早期发育的干扰作用。先前的研究已经将升高的同型半胱氨酸与神经管缺陷、神经嵴分层和迁移障碍以及血管功能改变联系起来。与此一致，我们识别出与这些过程相关的几个细胞群体中的转录变异，强调了同型半胱氨酸治疗对早期胚胎谱系的广泛影响。重要的是，整合和非整合分析一致地揭示了一类与血液前体相关的细胞群体——这是受同型半胱氨酸治疗影响最明显的谱系之一——进一步支持了我们系统的生物学相关性。专注于NMPs、旁轴中胚层和神经管细胞，这些细胞代表了参与神经管形态形成的主要组织，我们检测到神经身份的转录和比例变化最小，而中胚层和NMP群体受到的影响更为显著。这一新发现表明，尾部NT样表型可能源于中胚层谱系的损伤，而不是神经身份的直接破坏。这种解释得到了中胚层在神经管形态发生和后轴延长中关键作用的支持。此外，这些结果与HCys处理胚胎观察到的多尾表型以及糖尿病和非糖尿病小鼠模型中描述的神经管缺陷中的中胚层外泌是一致的。然而，同型半胱氨酸发挥这些效应的精确分子机制仍然具有推测性，需要进一步的研究来解析该分子直接影响及其在早期发育过程中破坏一碳代谢的间接后果。总之，我们的发现表明，将LMO标记与BD Rhapsody平台相结合为包括早期异质胚胎组织在内的复杂样本的高质量scRNA-seq分析提供了一种强有力的方法。这种方法为将单细胞研究扩展到非小鼠或人类生物体提供了重要潜力，并将多重工作流程的范围扩展到了分离敏感性较高和受环境影响的系统，其中的变化可能比遗传扰动更为微妙。

**研究的局限性**

我们研究的一个局限性在于注射程序的可重复性，因为每个卵子都存在内在差异，可能会在处理后引入结果的变异性。为了减轻这一点，我们汇集了多个样本以最小化胚胎间变异的影响。另一个局限性涉及分析的细胞数量：尽管数据集是稳健的，但它可能会受到BD Rhapsody试剂盒捕获不同细胞群体能力的影响。尽管如此，预期的细胞群体的识别与我们之前使用非多重技术和基于滴落的单细胞平台生成的数据集是一致的，这支持了当前数据的准确性。最后，关于生物学解释，这项工作只是一个初步步骤。虽然我们的分析揭示了处理组和未处理组胚胎之间的转录组差异，但还需要通过杂交链反应（HCR）或功能测定进一步验证观察到的变化，并更好地理解同型半胱氨酸在早期胚胎发育过程中的作用机制。

**资源可用性**

请求更多信息和资源应联系主要联系人Charlene Guillot（[e-mail]），她将满足您的要求。

**材料可用性**

本研究没有生成新的独特试剂。用于基于LMO的样本条形码编码和文库制备的定制寡核苷酸列在补充信息中。有关本研究使用的任何其他材料的信息，可以根据请求从主要联系人处获得。

**数据和代码可用性**

- 本研究生成和分析的单细胞RNA-seq数据已存放在NCBI Gene Expression Omnibus中，访问号为GEO: GSE303866，并在发表日期后公开可用。
- 所有原始代码已存放在Zenodo上，网址为https://doi.org/10.5281/zenodo.20593689，并在发表日期后公开可用。代码也可以在GitHub上找到：https://github.com/GuillotLabUCA/Maupetit-Maurelia-et-al-2026。
- 如果需要重新分析本文报告的数据，可以从主要联系人处获得任何其他信息。

**致谢**

作者感谢遗传与生殖研究所的Krzysztof Jagla博士提供的有益讨论、建议和评论。我们还要感谢BD团队和Seven Bridges的支持成员们的协助和技术帮助。作者还要感谢Romane Bertrand和Guillot实验室的成员，以及遗传、生殖与发展研究所提供的技术服务（SC3 – 单细胞与细胞培养设施、生物信息学平台（BIM）和Clermont共聚焦成像平台（CLIC）在实验组织方面的帮助。我们还要感谢研究所的行政和技术支持人员提供的持续协助。这项工作得到了CIR3 i-SIte Young Group Leader Fellowship（I04ABMECA/IR21GUILLOTCHAIR）对C.G.的支持，以及INSERM/UCA Junior Professor Chair和法国国家研究署（ANR-22-CPJ2-0084-01）对C.G.的支持。

**作者贡献**

- S.M.-M.：撰写、审阅和编辑、撰写初稿、可视化、方法学和研究。
- F.M.G.：撰写、审阅和编辑、可视化、软件、研究、正式分析和数据管理。
- P.H.：撰写、审阅和编辑、软件、正式分析和数据管理。
- N.A.：方法学和研究。
- Y.R.：软件、正式分析和数据管理。
- J.C.：审阅和编辑、监督和资源管理。
- C.G.：撰写、审阅和编辑、撰写初稿、项目管理和监督、资源管理、方法学、研究、正式分析、数据管理、资金获取和概念化。

**利益声明**

作者声明没有竞争利益。

**撰写过程中使用生成式AI和AI辅助技术的情况**

在准备这项工作时，作者使用ChatGPT（OpenAI）来协助英文编辑、改进句子结构、提高清晰度以及解决数据分析工作流的代码问题。该工具没有用于生成科学结论、独立分析数据或创建原始实验结果。使用该工具后，作者根据需要审查、编辑和验证了内容和代码，并对出版物的内容负有全部责任。

**方法关键资源表**

| **试剂或资源** | **来源** | **标识符** |
| --- | --- | --- |
| 固定生存力染料660 | BD Biosciences | Cat# 564405; RRID: AB_2869571 |
| MULTI-Seq LMO Lig-Anchor | Gene Link | Cat# 26-2202-02 |
| MULTI-Seq LMO Palm Co-Anchor | Gene Link | Cat# 26-2204-02 |
| Accutase | Gibco | Cat# A1110501 |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | Cat# H8264 |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | Cat# 05470 |
| L-同型半胱氨酸 | Sigma-Aldrich | Cat# 69453 |
| Anti-SOX2 | Bioscience | Cat# 14-9811-82; RRID: AB_11219471 |
| Anti-TBXT（山羊） | R&D Systems | Cat# AF2085 |
| 磷酸盐缓冲盐水 | Eurobio Scientific | Cat# CS1PBS02-01 |
| BD Rhapsody试剂盒 | BD Biosciences | Cat# 633731 |
| BD Rhapsody试剂盒 | BD Biosciences | Cat# 633733 |
| BD Rhapsody cDNA试剂盒 | BD Biosciences | Cat# 633773 |
| BD Rhapsody WTA扩增试剂盒 | BD Biosciences | Cat# 633801 |
| Agencourt AMPure XP磁珠 | Beckman Coulter Life Sciences | Cat# A63880 |

**数据存储**

- 单细胞RNA-seq数据：GEO: GSE303866
- 分析代码：https://doi.org/10.5281/zenodo.20593689

**实验模型：生物体/品系**

- 从法国的EARL Les Bruyères, Dangers获得的受精Gallus gallus JA57品系

**寡核苷酸**

- LMO样本条形码（SBCs）：参见表S2
- 定制引物和Atto550标记的LMO检测探针：参见表S3

**软件和算法**

- BD Rhapsody WTA分析流程，版本8：Seven Bridges（https://www.sevenbridges.com）
- RProject for Statistical Computing：v4.4.0；https://www.r-project.org
- RStudio：https://posit.co/download/rstudio-desktop
- Seurat：v5.1.0；https://satijalab.org/seurat/
- MULTI-seq：McGinnis等人（https://github.com/chris-mcginnis-ucsf/MULTI-seq）
- scDblFinder：Bioconductor（v1.24.0；https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/scDblFinder.html）

**其他**

- 40 μm细胞过滤器：Corning（Cat# CLS431750）
- BD FACSMelodyTM细胞分选仪：BD Biosciences
- FACSMelodyTM细胞分选仪：4200
- TapeStation系统：Agilent Technologies（G2991）
- BANovaSeq测序平台：Illumina/Novogene

**实验模型和研究参与者详情**

受精的Gallus gallus卵子（JA57品系）来自法国的EARL Les Bruyères, Dangers，维持在12°C下，并在标准条件下进一步孵育。为了进行实验处理，胚胎在卵黄中接受了20 μL的L-同型半胱氨酸溶液（Hcys，Sigma-Aldrich，Cat#69453）或对照溶液的亚胚胎注射。低剂量同型半胱氨酸处理的胚胎接受了20 μL的0.5 mM同型半胱氨酸溶液，高剂量同型半胱氨酸处理的胚胎接受了20 μL的19 mM同型半胱氨酸溶液，对照胚胎接受了20 μL的Hank’s Balanced Salt Solution（HBSS；Sigma-Aldrich，Cat# H8264）。假设在大约20 mL的卵黄体积内稀释，这些注射条件分别估计导致最终暴露剂量约为0.5 μM和19 μM的同型半胱氨酸。胚胎在孵育后72小时被收集，对应于Hamburger–Hamilton阶段18–19。处理组和对照组的胚胎在相同条件下并行处理以确保可比性。对于每个实验条件，从四个胚胎中分离出两个后部胚胎区域：两个胚胎的尾芽（代表最後形成的结构）和两个胚胎的后端（包括最后一个形成的体节、前体中胚层、后部神经管和尾芽）。分离的组织在冷HBSS中短暂冲洗，并在37°C下用Accutase（Gibco，Cat# A1110501）酶解15分钟，然后进行温和的机械研磨。产生的细胞悬浮液通过40 μm细胞过滤器过滤，使用血细胞计数仪评估细胞密度和存活率。细胞随后在4°C下以350 × g离心5分钟，然后放入0.25% BSA的PBS中重新悬浮，以便进一步处理。由于在本研究分析的发育阶段无法可靠地评估胚胎性别，因此未确定胚胎的性别；因此，无法评估潜在的性别特异性效应。

**伦理声明**

由于本研究仅涉及孵化前收集的早期Gallus gallus胚胎，符合欧洲指令2010/63/EU，因此不需要伦理批准。

**LMO插入分离的小鸡细胞膜的验证**

仅使用脂质修饰的寡核苷酸（LMOs）进行样本哈希。具体来说，使用MULTI-Seq LMO Lig-Anchor（Gene Link；Cat# 26-2202-02）和MULTI-Seq LMO Palm Co-Anchor（Gene Link；Cat# 26-2204-2）试剂来标记分离的小鸡胚胎细胞。对于LMO标记，将5 × 10^5个分离的细胞在冰上与Anchor LMOs孵育5分钟，然后加入等浓度的co-Anchor LMOs再孵育5分钟。同时测试了三种最终的Anchor/co-Anchor浓度：200 nM、20 nM和2 nM。为了同时监测细胞存活率和LMO整合情况，将细胞与Fixable Viability Stain 660（FVS660；BD Biosciences，Cat# 564405；来自储备液的1:200比例）和针对LMO手柄序列的Atto550标记探针一起孵育，最终浓度为0.1 μM。孵育后，细胞在4°C下以500×g离心10分钟，然后重新悬浮在HBSS中，并在BD FACS Melody流式细胞仪上进行分析。对照组包括未染色的细胞、仅含FVS660的细胞、仅含探针的细胞和含LMO和探针的细胞，这些细胞用于定义补偿、背景荧光和门控策略。使用FVS660染色排除死细胞，并根据Atto550荧光高于仅含探针的背景来识别LMO阳性细胞。

**基于LMO的样本多重化和BD Rhapsody单细胞捕获**

优化了单细胞分离方案，以确保捕获前存活率≥90%并最小化双胞胎的形成。对于基于LMO的样本条形码编码，从每个组织样本中取2.5 × 10^5个细胞，在补充有200 nM Anchor LMO和200 nM组织特异性样本条形码寡核苷酸的PBS中孵育。每个样本条形码被分配给特定的组织或处理条件。在冰上轻轻搅动并孵育5分钟后，加入200 nM co-Anchor LMO再孵育5分钟。然后通过4°C下500×g离心两次以去除多余的未结合LMOs。根据活细胞计数，每个样本加载16,000个活细胞，每次捕获最多40,000个细胞，按照制造商的说明将细胞放入预装的BD Rhapsody试剂盒中。将细胞捕获珠分配到每个微孔中，然后裂解细胞以释放mRNA和LMO衍生的样本条形码。mRNA分子和多聚腺苷酸化的样本条形码寡核苷酸随后通过polyA/polyT相互作用被珠捕获。珠子洗涤后，按照BD Rhapsody工作流程进行逆转录。

**LMO条形码文库**

为了恢复LMO衍生的样本条形码信息，从未结合到珠子的上清液中收集逆转录产物，并与整个转录组文库分开处理。首先使用MULTI-seq添加剂引物进行第一次PCR扩增，该引物专门识别样本条形码手柄序列。在使用AMPure XP珠（Beckman Coulter Life Sciences，Cat# A63880）和4200 TapeStation系统（Agilent）进行清洗后，验证了预期的扩增子大小约为138 bp。然后进行第二次PCR，添加Illumina P5和P7测序接头，使用表S3中列出的定制逆转录引物。最终的LMO条形码文库预期大小约为158 bp。

**整个转录组文库**

含有捕获mRNA的珠子按照制造商的说明使用BD Rhapsody WTA扩增试剂盒进行处理，无需修改。此工作流程生成了代表捕获的单细胞转录组的整个转录组扩增文库。

**测序**

LMO条形码和整个转录组文库以等摩尔浓度混合，然后由Novogene在Illumina NovaSeq平台上使用双端150 bp测序进行测序。测序深度配置为LMO条形码文库每个细胞约2,000个读段，整个转录组文库每个细胞约50,000个读段，以确保足够的覆盖度以实现稳健的多路分化和转录本定量。

**生物信息学处理和下游单细胞分析**

整个转录组和LMO条形码文库的FASTQ文件使用Seven Bridges平台上的BD Rhapsody WTA分析流程（版本8）进行处理。为了检索LMO条形码序列，使用样本条形码序列作为补充参考调整了VDJ对齐模块。这一步生成了过滤和未过滤的基因表达矩阵、BAM文件、LMO条形码计数矩阵和质量控制报告。对于样本多路分选，使用R v4.4.0和Seurat v5.1.0及MULTI-seq包分析了LMO衍生的独特分子标识符（UMI）计数。只有当细胞包含至少100个总LMO计数，并且至少三分之二的总LMO计数对应于单个样本特异性条形码时，才将细胞分配给相应样本。不符合这些标准的细胞被排除在下游分析之外，从而减少了模糊分配和由于条形码信号低或混合标记导致的误分类。

**伦理声明**这些过滤标准在解复用后被应用，以在下游聚类和双胞体检测之前去除低质量的细胞。为了进一步控制人工细胞轮廓的影响，使用scDblFinder在经过质量过滤的数据集上计算识别双胞体，并明确向算法提供样本身份，从而以样本意识的方式进行双胞体分类。被分类为双胞体的细胞被排除在外，只有被标记为单胞体的细胞被保留下来用于下游分析。经过归一化的数据集通过主成分分析（PCA）进行降维处理，并根据肘部图（elbow plot）的拐点选择主成分。无监督的Louvain聚类和UMAP可视化使用20个主成分和50个最近邻进行。对于集成分析，样本通过Seurat的互惠PCA集成或Harmony方法进行合并。集成参数在结果部分和相应的图例中有说明。每个簇的标记基因是通过接收者操作特征（ROC）测试识别的，分类效能通过ROC曲线下的面积（AUC）来评估。阳性标记基因根据调整后的p值进行排序，并通过交叉参考已知的发育调节因子和先前验证的胚胎表达数据（包括GEISHA注释和已发布的鸡胚胎数据集）来支持簇身份的分配。对于与处理相关的转录分析，在标记的簇内或子簇中识别出处理组和对照组之间差异表达的基因。为了集成基准测试，通过计算共享的阳性差异表达基因的百分比来比较集成簇和非集成基线注释。对于每个簇，使用按调整后p值排序的前200个阳性标记基因进行重叠比较。还量化了每个簇的阳性差异表达基因的数量，以评估集成是否减少了簇特有的转录特征。

**后轴发育的形态学和免疫染色分析**
为了评估同型半胱氨酸处理对后轴发育的影响，对对照组和同型半胱氨酸处理组的胚胎进行了成像和形态测量分析。从代表性的背腹图像中测量了整个胚胎的大小、前部区域的大小和后部区域的大小。通过针对TBXT（R&D Systems，Cat#AF2085）和SOX2（eBioscience，Cat#14-9811-82）的免疫染色进一步分析了尾部区域，以识别中胚层、神经和神经中胚层前体相关区域。使用DAPI染色来可视化细胞核并绘制解剖学标志，包括最后一个形成的体节。测量内容包括整个胚胎的大小、前部区域和后部区域的大小、最后一个形成的体节的宽度和长度、从最后一个形成的体节到尾端的距离、前体节段中胚层的宽度、后部神经管的宽度、与最后一个形成的体节相邻的前部神经管的宽度以及从神经管到尾端的距离。使用预定义的解剖学标志进行量化，并在对照组、低剂量同型半胱氨酸组和高剂量同型半胱氨酸组之间进行比较。

**量化和统计分析**
单细胞RNA-seq数据处理、解复用、质量控制、双胞体去除、聚类、集成和差异表达分析均使用R v4.4.0、Seurat v5.1.0、MULTI-seq、scDblFinder、Seurat互惠PCA集成和Harmony程序完成，具体细节见方法部分。只有那些显示清晰LMO条形码分配、检测到1,000–10,000个基因、线粒体基因含量低于25%并且被分类为单胞体的细胞才会被纳入下游分析。不符合这些标准的细胞被排除在外。
簇标记基因和与处理相关的差异表达基因是使用Seurat中实现的接收者操作特征测试识别的。分类效能通过接收者操作特征曲线下的面积来评估。对于集成基准测试，通过计算按调整后p值排序的前200个阳性标记基因共享的阳性差异表达基因的百分比来比较簇。
形态测量使用预定义的解剖学标志进行。每个比较使用的统计测试、n的确切值及其定义在相应的图例中给出。除非另有说明，n分别代表形态分析的胚胎数量和单细胞RNA-seq分析的细胞数量。除非另有说明，数据以平均值±标准误（SEM）的形式呈现。统计显著性定义为p < 0.05。确切的p值和多重检验校正方法在图表、图例或补充表中报告。
未进行正式的样本量估计。样本量是根据胚胎的可用性、技术可行性以及探索性胚胎学和单细胞RNA-seq实验的标准实践来确定的。来自不同处理条件的胚胎和样本在相同的实验条件下并行处理，以最小化技术变异。在样本制备过程中未应用随机化或盲法处理。图像量化和计算分析使用预定义的纳入和排除标准进行。

**额外资源**
• BD Rhapsody单细胞分析资源和文档：https://www.bdbiosciences.com/en-us/products/single-cell-multiomics
• Seurat单细胞分析文档：https://satijalab.org/seurat/
• 用于支持鸡胚胎基因表达注释的GEISHA数据库：https://geisha.arizona.edu/geisha/

**补充信息（2）**
下载全部内容：PDF（2.31 MB）
文档S1：图S1–S3及表S1–S3
存档（12.31 MB）：数据S1。BD Rhapsody/Seven Bridges HTML流程报告，用于在下游分析之前生成curated Seurat对象，与图2相关
* 在报告中，SBC2 = SBC1。