MORC1调控TRIM28的相互作用以及核凝聚体的形成，从而实现转座子的沉默

《iScience》：MORC1 coordinates TRIM28 interaction and nuclear condensate formation for transposon silencing

　　亮点：
• MORC1通过一个内在无序区域形成核凝聚体
• MORC1凝聚体限制扩散并调节染色质功能
• MORC1结合TRIM28并将其隔离在核凝聚体内
• MORC1协调自身以及TRIM28对年轻LINE-1元件的定位

摘要：
MORC1介导的转座子抑制涉及DNA甲基化和H3K9me3的沉积，但其潜在机制仍不清楚。在这里，我们展示了MORC1在生殖细胞中组装成离散的核体，并使用多西环素诱导的NIH3T3细胞系统定义了两个特性：MORC1通过一个包含双重核定位信号的内在无序区域（IDR）驱动核凝聚体的形成；MORC1结合TRIM28，这是一种招募H3K9甲基转移酶SETDB1的共抑制因子，并通过蛋白质-蛋白质相互作用将其集中在这些核体内。IDR缺失的MORC1突变体无法形成核凝聚体，但仍能结合TRIM28。染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）显示，这种突变体比野生型MORC1更强烈地占据异染色质中的转座子，特别是那些与内源性MORC1 target重叠的进化上较新的亚家族。值得注意的是，外源性MORC1在生殖细胞中形成的凝聚体明显大于内源性MORC1形成的凝聚体，荧光恢复后漂白（FRAP）分析表明MORC1凝聚体限制了扩散。我们提出了一个模型，其中MORC1的功能受到TRIM28的协同作用以及IDR依赖的凝聚体形成的定量限制。

引言：
Microrchidia家族的CW型锌指（MORC）蛋白在从原核生物到真核生物的各种生物中都具有进化保守性。在人类中，已经鉴定出四个同源蛋白MORC1-MORC4。小鼠基因组编码五个同源蛋白MORC1、MORC2a、MORC2b、MORC3和MORC4，每个都具有不同的生物学功能。其中，MORC2a是一种GHKL ATP酶，作为HUSH复合体的效应因子，参与异染色质的压缩和基因沉默。MORC2b是MORC2a的啮齿动物特异性同源物，调节减数分裂程序，而MORC3在小鼠胚胎干细胞中参与转座子沉默。相比之下，MORC4的功能仍然知之甚少。MORC1的独特之处在于它具有生育特异性作用：其缺乏会导致男性不育，而对其女性生殖功能没有可检测的影响。值得注意的是，MORC介导的转座子沉默在植物中也得到了保守，其中MORC蛋白与RNA导向的DNA甲基化途径协同作用。然而，与小鼠不同，植物MORC蛋白的破坏通常不会导致明显的不育。
MORC1在小鼠的生殖细胞中高度表达，这些细胞从胚胎第13.5天（E13.5）持续到出生后第3天（P3）。在这些细胞中，基因组DNA甲基化通过从头DNA甲基化逐渐建立，在P0时达到稳定水平。如果不能重新建立DNA甲基化，会导致持续的转座子激活，从而通过诱导DNA双链断裂来破坏减数分裂。生殖细胞中的转座子沉默还涉及组蛋白修饰，如H3K9三甲基化（H3K9me3），以及DNA甲基化。在小鼠中，这些表观遗传机制主要由两个蛋白家族介导：Krüppel相关盒域锌指蛋白（KRAB-ZFPs）和PIWI蛋白。KRAB-ZFPs结合特定的转座子衍生的基因组序列，并招募支架蛋白triptartite motif-containing 28（TRIM28；也称为KRAB相关蛋白1 [KAP1]），通过与H3K9甲基转移酶SETDB1、从头DNA甲基转移酶DNMT3以及介导组蛋白H3K9去乙酰化的NuRD复合体等因子的相互作用来促进染色质重塑。这些修饰因子在转座子位点建立抑制性的染色质状态和DNA甲基化。KRAB-ZFP家族在哺乳动物中迅速扩展，可能是为了应对不断进化的转座子威胁。
PIWI蛋白携带PIWI相互作用RNA（piRNAs），组装piRNA诱导的沉默复合体（piRISCs），通过RNA-RNA碱基配对来靶向转座子转录本。在小鼠中，两种PIWI蛋白MILI（PIWIL2）和MIWI2（PIWIL4）分别在细胞质和细胞核中起作用。MIWI在细胞质中切割转座子转录本，而MIWI2通过涉及DNA甲基化和组蛋白修饰的转录沉默来抑制转座子。当新的转座子侵入生殖细胞基因组时，会生成针对新转座子的新的piRNAs。因此，像KRAB-ZFPs一样，PIWI-piRNA途径也是对新出现的转座子的一种响应，反映了持续的军备竞赛。
我们最近发现，在MORC1缺失的生殖细胞中被解除抑制的转座子大部分与在MIWI2突变体中被解除抑制的转座子重叠，这表明MORC1有助于MIWI2依赖的转座子沉默。同时，在MORC1缺失的生殖细胞中，转座子位点的H3K9me3水平下降，伴随着染色质的开放，支持MORC1通过在一部分转座子上重新建立H3K9me3来促进异染色质形成的模型。然而，由于MORC1表达主要限于小鼠的雄性生殖细胞，因此缺乏详细的机制分析。

本研究首先用抗MORC1抗体对小鼠生殖细胞进行免疫染色，发现MORC1形成了离散的核凝聚体。由于在生殖细胞中详细分析这些结构在技术上具有挑战性，我们在NIH3T3细胞中建立了一个多西环素（Dox）诱导的MORC1表达系统。尽管NIH3T3细胞缺乏PIWI途径，但它们保留了核心的基因调控机制，为机制分析提供了可行的平台。

结果：
MORC1通过IDR介导的相分离组装核凝聚体
为了评估MORC1的内源性行为，我们用抗MORC1抗体对小鼠的雄性生殖细胞进行了免疫染色。在MVH阳性细胞（图1A和S1A）中检测到MORC1，形成了中位数估计面积为0.043 μm2的离散核灶（“MORC1体”）（图S1B）。MVH是一种特异性生殖细胞RNA解旋酶，广泛用作识别生殖细胞的标记。先前的研究报告称，MORC1在小鼠生殖细胞中分布更为分散。这种差异可能反映了不同研究中使用的抗体之间的差异。鉴于相分离在染色质动力学和基因调控中的重要性日益凸显，我们的发现——即MORC1这种生殖细胞特异性的转座子沉默因子形成凝聚体——进一步支持了相分离有助于生殖细胞基因调控的观点。

图1：MORC1通过一个包含bpNLS的IDR组装核凝聚体
(A) 内源性MORC1（绿色）在E17.5胚胎睾丸的MVH阳性（红色）生殖细胞中形成离散的核灶（“MORC1体”）。刻度尺，10 μm。
(B) 在多西环素诱导下，FLAG-MORC1（绿色）在NIH3T3细胞中形成核凝聚体。用DAPI（蓝色）染色的细胞核（白色虚线轮廓）。刻度尺，10 μm。
(C) MORC1结构域图及其下游预测的IDR（蓝色，氨基酸541–780）位于CW结构域（橙色，氨基酸470–532）之后。
(D) MORC1 ΔIDR（绿色）在NIH3T3细胞中分散在细胞质中。用DAPI（蓝色）染色的细胞核。刻度尺，10 μm。
(E) bpNLS突变体（绿色）在细胞质中定位。bpNLS_m1：Arg620、Lys623和Arg624被替换为丙氨酸；bpNLS_m2：Lys640、Lys643和Lys644被替换为丙氨酸。用DAPI（蓝色）染色的细胞核。刻度尺，10 μm。
(F) MORC1 ΔIDR-bpNLS突变体（绿色）定位于细胞核中，但未能形成凝聚体。用DAPI（蓝色）染色的细胞核。刻度尺，10 μm。
(G) 将MORC1 bpNLS与mCherry-MVH（红色）融合后，融合蛋白被定向到细胞核。用Hoechst 33342（蓝色）染色的细胞核。刻度尺，10 μm。
(H) MORC1（野生型和突变体）的细胞内定位和动态。

由于在生殖细胞中对这些凝聚体进行进一步的多方面分析在技术上具有挑战性，我们在NIH3T3细胞中生成了一个多西环素诱导的FLAG-MORC1细胞系。短读长RNA-seq显示，NIH3T3细胞内源性表达Morc2a（NCBI基因ID：74522）、Morc3（338467）和Morc4（75746），但不表达Morc1（17450）或Morc2b（240069）（图S1C和S1D）。相比之下，雄性生殖细胞的RNA-seq数据显示，MORC1在生殖细胞中的表达最高，其次是Morc3和Morc2a，而Morc2b和Morc4的表达很少或没有（图S1E）。
在多西环素诱导下，抗FLAG免疫染色显示MORC1形成的核凝聚体明显大于生殖细胞中的MORC1体（中位数面积0.144 μm2）（图1B和S1B；100 ng/mL持续48小时）。凝聚体中心有时会减弱信号，产生环状形态，这与抗体排除密集相或已知会发生相分离的蛋白质一致。凝聚体经常与DAPI亮色结构相邻（图1B），可能是 constitutive 异染色质或核仁，尽管这种邻近关系的功能相关性尚不清楚。
生殖细胞中的MORC1体型小得多，且没有环状形态（图1A、1B和S1B）。为了研究观察到的大小差异是否可以归因于MORC1的表达水平，我们在NIH3T3细胞中对多西环素诱导的MORC1表达进行了滴定。仅缩短诱导时间（100 ng/mL持续24小时；中位数面积0.104 μm2）并没有显著改变凝聚体的大小，与标准条件（100 ng/mL持续48小时）相比。将多西环素浓度降低到10 ng/mL持续24小时后，凝聚体的中位数面积减少到0.087 μm2，尽管这个值仍然是生殖细胞凝聚体的大约2.0倍。进一步将多西环素浓度降低到1 ng/mL持续24小时后，凝聚体完全消失（图S1F）。这些发现表明，生殖细胞中凝聚体的较小尺寸不能仅归因于MORC1表达的减少。相反，生殖细胞特异性因素，如核结构、染色质环境或细胞类型特异性的相互作用伙伴，也可能参与体内凝聚体性质的调节。
由于许多形成凝聚体的蛋白质依赖于内在无序区域（IDRs），我们用DISOPRED3对MORC1进行了分析。这识别出位于CW结构域下游的预测IDR（图1C和S1G）。我们删除了这部分序列，并在NIH3T3细胞中表达了突变体（MORC1 IDR删除 [ΔIDR]）。与野生型（WT）MORC1不同，ΔIDR突变体未能形成核灶，而是在细胞质中呈现扩散分布（图1D），表明IDR对于核凝聚体的组装是必需的，并可能有助于核定位。

MORC1的IDR包含一个双部分NLS，该NLS对核颗粒的组装至关重要，并抑制细胞质颗粒的形成
我们使用cNLS Mapper查询了MORC1 IDR的核定位信号（NLS），并识别出一个典型的双部分NLS（bpNLS），其范围为Arg620–Ser645（图1E和S1G）。该基序包含两个碱性簇：N端侧的Arg620–Arg624和C端侧的Lys640–Lys644。
为了测试功能，我们在每个簇中的三个碱性残基上分别替换为丙氨酸：Arg620/Lys623/Arg624（bpNLS_m1）或Lys640/Lys643/Lys644（bpNLS_m2）。这两种突变体都失去了核定位，而是在细胞质中形成了聚集物（图1E），表明预测的区域确实是一个有效的bpNLS，并且核导入虽然是核颗粒所必需的，但对于凝聚体的组装本身并不是必需的。
接下来，我们将bpNLS恢复到IDR删除的突变体（ΔIDR-bpNLS）中。融合蛋白定位于细胞核中，但未能形成MORC1颗粒（图1F），表明IDR对于凝聚体的形成是不可或缺的，而bpNLS仅足以实现导入。将MORC1 bpNLS与主要位于细胞质的MVH（mCherry-MVH）融合后，使其在细胞核中积累，而单独的mCherry-MVH仍然留在细胞质中（图1G），证明MORC1 bpNLS足以赋予核定位活性。
这些结果支持一个模型（图1H），其中运输因子与MORC1 bpNLS结合以促进核导入，从而防止MORC1在细胞质中积累，否则它会在细胞质中形成凝聚体。值得注意的是，对于纺锤体组装因子TPX2也报道了类似的机制。
为了研究MORC1凝聚体的生物物理特性，我们进行了荧光恢复后漂白（FRAP）分析。对于WT MORC1，单个凝聚体被光漂白，而对于不形成明显凝聚体的ΔIDR-bpNLS，则光漂白了等面积的核区域。WT MORC1的荧光恢复速度明显慢于ΔIDR-bpNLS，中位数恢复时间常数分别为37.8秒和5.27秒（图S1H和S1I）。这种显著差异表明，IDR依赖的凝聚体形成显著限制了MORC1的分子移动性，从而减少了可用于基因组监控的游离扩散MORC1的数量。

MORC1结合并集中TRIM28到MORC1颗粒中
我们在NIH3T3细胞中分析了与MORC1相互作用的蛋白质。在多西环素诱导MORC1表达后，通过质谱（MS）分析了抗FLAG免疫沉淀物（表S1）。来自三个生物学重复实验的火山图（图S2A）显示了许多在MORC1免疫沉淀物中富集的蛋白质（图2A）。为了优先考虑候选蛋白，我们使用SETDB1（一种参与转座子沉默的H3K9me3甲基转移酶）作为网络锚点，将STRING相互作用得分叠加在结果上。TRIM28在top hits中脱颖而出，其STRING置信度很高（combined STRING score：0.996），并且MS富集度也很强（log2 abundance ratio >2.9；-log10 p > 1.5）（图2A和2B）。TRIM28和其他网络支持的因子在图2A和2B中突出显示。MORC1与TRIM28强烈共沉淀，而阴性对照（mCherry）则不共沉淀（图2C），这支持了MORC1位于TRIM28/SETDB1轴上的位置。

图2：MORC1结合并集中TRIM28到MORC1凝聚体
(A) 显示在NIH3T3细胞中与MORC1共沉淀的蛋白质的火山图。出现在(B)中的蛋白质由蛋白质名称指定。TRIM28用红色表示。边上的箭头表示组合的STRING得分。(C) 在NIH3T3细胞中外源表达的MORC1和TRIM28的共免疫沉淀。(D) 在Dox(-) NIH3T3细胞中，TRIM28（红色）在细胞质中分散分布，但在其表达时（Dox(+)）与MORC1（绿色）共定位。细胞核用DAPI（蓝色）染色。比例尺，10 μm。(E) 当表达MORC1 ΔIDR-bpNLS（绿色）而不是WT时，TRIM28（红色）仍然位于细胞质中。细胞核用DAPI（蓝色）染色。比例尺，10 μm。(F) TRIM28 ΔPHD突变体（红色）能够有效地重新定位到MORC1凝聚体（绿色）中，而ΔBROMO突变体（红色）则无法定位到它们。细胞核用DAPI（蓝色）染色。比例尺，10 μm。(G) TRIM28 ΔNLSΔBROMO（红色）和MORC1-bpNLS_m1（绿色）不能共定位。细胞核用DAPI（蓝色）染色。比例尺，10 μm。(H) TRIM28 ΔNLS（红色）和MORC1-bpNLS_m1（绿色）在不同的细胞质焦点中共定位。细胞核用DAPI（蓝色）染色。比例尺，10 μm。(I) 免疫荧光实验总结。免疫荧光显示，在没有MORC1诱导的naive NIH3T3细胞中，内源性TRIM28主要位于细胞质中（Dox(-)；见图2D）。在MORC1诱导后，TRIM28显著地与MORC1核颗粒共定位（Dox(+)），表明MORC1通过蛋白-蛋白相互作用将TRIM28招募到MORC1凝聚体中。TRIM28的溴结构域介导TRIM28与MORC1的结合。用IDR缺失的突变体（ΔIDR-bpNLS）替换WT MORC1会消除TRIM28的聚集：TRIM28主要保持在细胞质中，如同MORC1缺乏的细胞一样（见图2E）。值得注意的是，ΔIDR-bpNLS仍然能够与内源性TRIM28共免疫沉淀（见图S2B），这表明MORC1-TRIM28的结合可以与MORC1颗粒的形成分离。为了确定所需的TRIM28区域，我们生成了ΔPHD（PHD结构域缺失）和ΔBROMO（溴结构域缺失）突变体（见图S2C）。PHD结构域促进相邻溴结构域的SUMO化，后者再招募如SETDB1等抑制因子来沉默目标，包括转座子。与WT MORC1共表达时，ΔPHD会强烈地聚集到MORC1颗粒中，而ΔBROMO则无法定位到颗粒中，仍分散在细胞核中（见图2F）。共免疫沉淀（coIP）检测到MORC1与ΔPHD的相互作用，但未检测到与ΔBROMO的相互作用（见图S2D），表明溴结构域对MORC1的相互作用和颗粒招募都是必不可少的。TRIM28的IDR内还包含一个bpNLS区域（Glu462–Asp494；见图2G和S2C）。缺乏这个NLS的ΔBROMO突变体无法与细胞质中的MORC1-bpNLS_m1共聚集（见图2G）。然而，恢复溴结构域后，ΔNLS突变体能够与MORC1-bpNLS_m1共定位（见图2H），进一步支持了溴结构域在MORC1依赖的颗粒招募中的作用。图2I总结了这些免疫荧光实验的亚细胞定位模式和MORC1-TRIM28的相互作用状态。CW结构域决定了TRIM28的家族特异性浓度。尽管MORC家族成员具有相似的整体结构域架构（见图3A），但它们在NIH3T3细胞中的行为明显不同。MORC1、MORC3和MORC4形成了核焦点，其中MORC3和MORC4倾向于形成更大的结构，而MORC2a和MORC2b主要分布在细胞质中（见图3B）。此前已有报道称人类MORC3会形成核颗粒。此外，参与核RNAi和染色质压缩的线虫MORC-1也通过二聚化和结合DNA环形成核颗粒。图3显示MORC1在MORC家族成员中对TRIM28的亚细胞定位影响最强。图2A显示了MORC1家族成员的结构域组织。每个成员的IDR是根据其与MORC1 IDR的氨基酸序列同源性确定的。图2B展示了MORC1家族成员（绿色）在NIH3T3细胞中的亚细胞定位，TRIM28用红色表示。细胞核用DAPI（蓝色）染色。比例尺，10 μm。图2C显示MORC1_3-IDR嵌合体（绿色）将TRIM28（红色）聚集到核凝聚体中。细胞核用DAPI（蓝色）染色。比例尺，10 μm。图2D显示MORC1_3-CW/IDR嵌合体（绿色）未能将TRIM28（红色）聚集到凝聚体中。细胞核用DAPI（蓝色）染色。比例尺，10 μm。接下来，我们比较了每个MORC成员如何改变TRIM28的定位（Dox(-)，见图2D）。MORC2a、MORC2b和MORC4的影响最小；MORC3部分将TRIM28转移到焦点中；MORC1产生了最强的积累（见图3B和S3A）。在这些成员中，MORC2a、MORC3和MORC4在naive NIH3T3中是内源性表达的（见图S1D），这与它们对TRIM28的影响有限一致（MORC3的影响较弱）。由于MORC1的IDR对颗粒形成是必需的，我们探讨了结构域差异是否解释了这种功能差异。用MORC3的IDR（MORC1_3-IDR）替换MORC1的IDR后，TRIM28的重新定位与WT MORC1相当（见图3C）。相比之下，同时替换CW结构域和IDR（MORC1_3-CW/IDR）显著降低了TRIM28的浓度，尽管形成了明显的核焦点（见图3D）。CW锌指是一种染色质读取器；MORC1和MORC3的CW结构域之间的序列同源性较低（31.7%；见图S3B），且MORC3的CW结构域优先结合H3K4me3，这是活跃基因的标记。这些数据表明，虽然IDR许可凝聚体的形成，但CW结构域是决定家族特异性的主要因素，并控制与其他模块的相互作用。替换CW结构域后，MORC1将目标重新定位到H3K4me3标记的染色质上，同时减弱了其与TRIM28的相互作用。这解释了在MORC1_3-CW/IDR条件下观察到的TRIM28招募减少的现象。在这种情况下，活性标记引导的染色质识别要么与TRIM28结合竞争，要么稀释了TRIM28的结合。MORC1和TRIM28的核共定位以及它们的蛋白-蛋白相互作用表明它们可能共同占据基因组位点。为了验证这一点，我们在表达FLAG-MORC1 WT的NIH3T3细胞中进行了染色质免疫沉淀后的测序（ChIP-seq），使用抗FLAG和抗TRIM28抗体。因为ΔIDR-bpNLS突变体未能形成核凝聚体（见图1F），但保留了与WT相当水平的TRIM28结合（见图S2B），我们也分析了这个突变体（见图4A）。为了评估MORC1的存在与否对染色质景观的影响，我们还在表达FLAG-mCherry（对照组）、FLAG-MORC1 WT或ΔIDR-bpNLS突变体的NIH3T3细胞中进行了可转座酶可访问染色质的测序（ATAC-seq，见图4A和S4A–S4C）。图4显示MORC1优先与进化上较新的转座子结合。图4A显示了MORC1和TRIM28的ChIP-seq和ATAC-seq谱型。信号轨迹是从每种条件下两个生物学重复样本的合并BAM文件生成的。MORC1 ΔIDR和ΔIDR-bpNLS突变体；对照组，mCherry。蓝色突出显示了在ΔIDR突变体中相对于WT特异性识别的MORC1峰值。图4B显示了在WT（蓝色）和ΔIDR（红色）样本中检测到的MORC1 ChIP-seq峰值数量。图4C显示了由ATAC-seq峰值定义的开放或封闭染色质区域中MORC1 ChIP-seq峰值的分布。上图为WT；下图为ΔIDR。图4D显示了MORC1 ChIP-seq峰值作为基因启动子、转座子（TE）或未注释的分类。上图为WT；下图为ΔIDR。图4E显示了按两种条件下的总峰值覆盖率排序的MORC1 WT和ΔIDR峰值在每个TE家族中的数量（左y轴，计数）。图4F显示了MORC1 ΔIDR峰值最常占据的前15个TE亚家族， binding频率按每100个位点标准化。进化上较新的亚家族（见图S4M）用蓝色突出显示。图4G显示了Morc1敲除（KO）和杂合（Het）小鼠的P3生殖细胞中TE表达的变化。显著上调的TE亚家族用红色突出显示，（F）中列出的亚家族已注释。图4H显示了在表达MORC1 ΔIDR的NIH3T3细胞和对照（mCherry）细胞之间TE亚家族的表达变化。q.value <0.01且log2FC >2、>0、<0或< -2的亚家族按图例说明进行注释。图4F中列出的亚家族用亮红色突出显示。我们首先比较了WT和突变体MORC1的ChIP-seq数据集。峰值调用在WT中识别出19,455个峰值，在ΔIDR-bpNLS突变体中识别出112,780个峰值（见图4B），尽管WT和突变体MORC1的表达水平相当（见图S4D）。这些结果表明IDR依赖的凝聚体形成限制了MORC1的基因组占据。与ATAC-seq数据集的比较显示，50.8%的WT峰值（n = 9,883）和75.0%的突变体峰值（n = 84,562）位于封闭的染色质中（见图4C）。这表明WT MORC1对异染色质区域的访问减少。相比之下，通过ATAC-seq测量的全局染色质可访问性在WT表达细胞和突变体表达细胞之间基本不变（见图S4E）。因此，在这种情况下，外源MORC1与NIH3T3染色质的结合似乎不足以重塑已建立的染色质景观。几乎所有NIH3T3细胞中的转座子都位于封闭的染色质中（98.3%；见图S4F）。与此一致，75.4%的ΔIDR-bpNLS峰值（n = 85,067）映射在转座子序列上，而只有52.8%的WT峰值（n = 10,277）如此（见图4D）。接下来，我们量化了含有WT或突变体MORC1峰值的转座子位点数量，分别识别出17,508个和119,105个转座子（见图S4G）。重叠是不对称的：68.4%的WT结合的转座子也被突变体结合，而只有10.0%的突变体结合的转座子与WT重叠。这与WT MORC1对异染色质嵌套的转座子的访问受限一致。尽管不那么明显，但MORC1，特别是WT，也显示出对基因启动子的显著结合（23.3%；见图4D）。为了确定哪些基因是MORC1优先靶向的，我们检查了其结合的启动子，并发现了许多参与RNA处理和/或翻译的基因（见图S4H）。突变体显示出较低的启动子结合（6.9%；见图4D），但与相似的功能类别相关（见图S4I）。这种偏差表明，无论IDR是否存在，MORC1的结合并非完全随机。为了检查MORC1表达和染色质结合是否与基因表达的变化相关，我们在表达mCherry、WT MORC1或ΔIDR-bpNLS突变体的NIH3T3细胞中进行了RNA-seq（见图S4J）。然后我们将MORC1结合的基因分类为WT特有的、突变体特有的和共有的（常见）类别（见图S4K）。这一分析表明，在NIH3T3细胞中，无论是由WT MORC1还是缺乏IDR的突变体结合的MORC1，其启动子结合在很大程度上与可检测到的稳态基因表达变化无关（见图S4L）。一致的是，启动子附近的染色质特征大致不变，通过ATAC-seq在不同条件下评估的TSS中心的染色质可访问性也没有明显差异（见图S4L）。这些观察表明，启动子关联本身在NIH3T3细胞中的转录效应有限。MORC1优先结合年轻的LINE_L1和LTR_ERVK元件。由于在表达ΔIDR-bpNLS突变体的细胞中MORC1结合的转座子数量显著高于表达WT MORC1的细胞（见图4E），我们接下来比较了WT和突变体在不同转座子类中的占据情况（见图4E）。这项分析显示，ΔIDR-bpNLS突变体在多个转座子类中的富集程度比WT MORC1更广，尤其是在LINE_L1元件中最为明显（log2(突变体/WT) = 3.23；见图4E）。亚家族水平的进一步分析显示，ΔIDR-bpNLS峰值在进化上较新的LINE_L1和LTR_ERVK亚家族中优先富集（见图4F和S4M），而在随机峰值或WT MORC1峰值中未观察到这种富集（见图S4M-S4P）。我们之前确定了在MORC1缺乏的生殖细胞中被降级的转座子。因此，我们将这些元件与在NIH3T3细胞中外源表达的MORC1结合的元件进行了比较。值得注意的是，ΔIDR-bpNLS突变体，但不是WT MORC1，与这些被降级的、进化上较新的元件有显著的重叠（见图4F、4G、S4O和S4Q）。这一观察表明，无论是在生殖细胞中内源性表达还是在NIH3T3细胞中外源表达，MORC1似乎都倾向于靶向类似的转座子子集。尽管在转座子位点有明显的占据，特别是在ΔIDR-bpNLS突变体中，但在WT或ΔIDR-bpNLS条件下，MORC1的结合对转座子表达的影响很小（见图4H和S4R）。这种有限的转录效应可能是因为大多数转座子已经位于强烈抑制的异染色质中。接下来，我们分析了TRIM28的ChIP-seq数据集，发现67,977个转座子在对照组（表达mCherry的细胞）中含有TRIM28峰值，而在MORC1（ΔIDR-bpNLS）表达的细胞中有140,788个转座子含有TRIM28峰值（见图5A），表明MORC1表达后TRIM28在转座子位点的占据增加了2.1倍。图5显示了MORC1在年轻转座子位点与MORC ΔIDR的结合。图5显示了在对照组（mCherry；灰色）和MORC1 ΔIDR表达（紫色）样本中含有TRIM28 ChIP-seq峰值的转座子数量。图5显示了含有MORC1 ΔIDR峰值和TRIM28峰值的转座子的分类方案。第一组（白色）包含同时含有MORC1 ΔIDR和TRIM28峰值的转座子；第二组（红色）仅包含MORC1 ΔIDR峰值；第三组（紫色）仅包含TRIM28峰值。I组转座子进一步被细分为μ-I组（MORC1-优先；浅红色），在该组中，相对于对照细胞，在MORC1-ΔIDR细胞中新检测到了TRIM28峰值；以及τ-I组（TRIM28-优先；浅紫色），在该组中，TRIM28峰值在对照细胞中已经存在。热图显示了τ-I组、μ-I组、II组和III组中转座子的MORC1 ΔIDR和TRIM28富集情况。所有热图中的转座子都是按照MORC1 ΔIDR富集程度排序的（左侧）。MORC1 ΔIDR的表达增强了μ-I组转座子位点上的TRIM28积累。最常见的MORC1结合元件包括τ-I组、μ-I组和II组的转座子家族。μ-I组和τ-I组中前10个转座子亚家族的列表（分别用E和F表示），其结合频率按每100个位点进行了标准化。进化上较新的亚家族（见图S4M）用蓝色标出。图中还显示了I组（μ-I组和τ-I组）转座子比例与P3型Morc1缺陷生殖细胞中表达变化之间的相关性（底部）。线条图显示了P0型Morc1杂合和KO生殖细胞中τ-I组、μ-I组、II组转座子的相对H3K9me3富集情况。接下来我们探讨了这些被TRIM28结合的转座子中有多少也与MORC1（ΔIDR-bpNLS）相关（见图S5A）。这项分析确定了68,094个同时被TRIM28和MORC1结合的转座子（图5B中虚线围出的白色区域）。在其余的转座子中，有51,011个仅被MORC1结合（MORC1-优先；II组，红色），而72,694个仅被TRIM28结合（TRIM28-优先；III组，紫色）。我们进一步将I组转座子分为两类：一类是在MORC1表达之前就已经被TRIM28结合的位点（TRIM28优先；τ-I组，n = 29,807；43.8%）；另一类是在MORC1结合的同时或之后才被TRIM28结合的位点（MORC1优先；μ-I组，n = 38,287；56.2%）（图5B）。我们还检查了每个组（τ-I组、μ-I组、II组和III组）中转座子上MORC1和TRIM28的分布情况（图5C）。热图显示MORC1在τ-I组、μ-I组和II组转座子上表现出相对稳定的富集，而如预期的那样，在III组转座子上几乎没有富集现象。TRIM28在μ-I组转座子（MORC1优先）中显著增加（从顶部第二行的洋红色面板可以看出）。相比之下，τ-I组、II组和III组的变化较小。这些数据定义了转座子位点上MORC1/TRIM28共占用的不同类别。接着，我们从τ-I组、μ-I组和II组中提取了被MORC1结合的转座子，并按转座子家族进行分类。每个组都有独特的特征：例如，LINE_L1元件在μ-I组中最丰富，而LTR_ERVK元件在τ-I组中占主导地位（图5D）。我们进一步量化了τ-I组和μ-I组中各个转座子亚家族的富集情况。μ-I组明显富集了进化上较新的LINE_L1亚家族（图5E）。一致地，另一项分析显示，在MORC1表达和结合后，这些年轻LINE_L1亚家族上的TRIM28占位增加（见图S5B）。相比之下，τ-I组倾向于LTR_ERVK元件，特别是Intracisternal A-particle（IAP）亚家族的富集尤为明显（图5F）。μ-I组和τ-I组的某些转座子与MORC1缺陷生殖细胞中抑制的转座子高度相似（见图5G、S5C和S5D）。μ-I组在MORC1缺陷生殖细胞中也显示H3K9me3水平降低（图5H），这表明MORC1与TRIM28相关的抑制作用存在关联。总之，这些结果表明，根据它们与TRIM28的关系，MORC1结合的转座子可以分为不同的类别，其中μ-I组在进化上较新的LINE_L1元件上显示出最明显的MORC1相关TRIM28招募证据。

讨论
在这项研究中，我们使用Dox诱导的MORC1表达系统在NIH3T3细胞中进行分析，这些细胞本身不表达MORC1，以此来解析MORC1的固有特性。这种方法揭示了MORC1的两个关键特征：首先，MORC1通过含有中心定位的bpNLS的IDR形成核凝聚体。这一特性与MORC3和MORC4相同，但与MORC2a或MORC2b不同。其次，MORC1与TRIM28强烈相互作用，并将其集中在核凝聚体内。这一特性在MORC家族成员中似乎是MORC1所独特的。我们的结果进一步表明，MORC1凝集体形成的影响不仅包括染色质结合的范围，还包括其结合位点的质量。虽然野生型MORC1对闭合染色质的结合有限，但ΔIDR能够更广泛地占据闭合区域。这些发现表明，凝聚体的物理体积或相关的局部分子占据情况有助于塑造MORC1的染色质结合模式。此外，凝聚体的形成可能会影响MORC1在细胞核内的有效定量分布。与这一观点一致，FRAP分析显示凝聚体的形成显著限制了MORC1的流动性，支持了核凝聚体限制了可用于染色质探索的MORC1自由扩散池的模型。尽管这些特性在NIH3T3细胞中的异位表达中显而易见，但MORC1表达并未显著改变预先存在的TRIM28/SETDB1依赖的抑制作用。一种可能的解释是，我们系统中的MORC1表达是短暂性的。原则上，可以建立稳定且持久的MORC1表达；然而，由于NIH3T3细胞和其他体细胞通常不表达MORC1，持续的表达可能不被细胞很好地耐受，并可能带来负担。另一种可能性是，NIH3T3细胞中的大多数MORC1结合转座子已经嵌入在强烈抑制的异染色质中，从而限制了异位MORC1对转录或染色质状态的可检测影响。MORC1的需求似乎高度依赖于具体环境。在生殖细胞中，MORC1对于转座子沉默至关重要，其缺失会导致转座子去抑制。此外，在MORC家族成员中，MORC1是唯一在生殖细胞中高表达的成员。这些观察表明，生殖细胞代表了一个需要MORC1独特特性的细胞环境，特别是其与TRIM28的强烈相互作用。因此，MORC1可能通过与TRIM28和SETDB1在转座子位点上的合作来支持高效的转座子沉默。

同时，MORC1如何招募到特定转座子亚家族的机制仍不清楚。KRAB-ZFPs是合理的候选者，鉴于它们在序列特异性转座子识别和TRIM28招募中的作用，但也不能排除其他因素的参与。与NIH3T3细胞和其他体细胞类型不同，生殖细胞具有PIWI-piRNA通路，这表明该通路可能至少部分地参与了MORC1的靶向或功能。特别是，PIWI-piRNA通路成分可能在年轻LINE_L1元素的DNA甲基化中起更直接的作用，同时还有SPOCD1、SPINDLIN1和核孔成分TPR等因子。MORC1凝聚体在NI3T3细胞和生殖细胞中的作用也可能有所不同。认为在MORC1表达开始时，生殖细胞的染色质相对较为开放，因此，大型凝聚体对染色质结合的限制可能不如NIH3T3细胞明显。然而，随着染色质逐渐变得不那么可访问，凝聚体的形成可能有助于限制MORC1进入已经闭合的区域，并促进其有效地定位到仍然可访问的区域。凝聚体的形成也可能微调MORC1-TRIM28复合物的局部浓度或有效剂量，这是单靠转录或翻译控制难以实现的。可以通过在MORC1缺陷生殖细胞中表达MORC3或在相同背景下表达缺失IDR的MORC1突变体来测试这一模型。这样的实验应该有助于区分MORC1特异性TRIM28相互作用和凝聚体形成的贡献，从而阐明这两种特性如何共同支持生殖细胞中的转座子沉默。

研究的局限性
这项研究主要依赖于NIH3T3成纤维细胞中的Dox诱导MORC1表达系统。虽然该系统能够控制MORC1结构域、凝聚体形成、TRIM28相互作用和染色质占据情况，但它并不能完全再现生殖细胞的环境，在那里内源性MORC1与生殖系特异性通路和染色质状态共同作用。特别是，NIH3T3细胞中观察到的表达依赖性凝聚体特性是否适用于生殖细胞中的内源性MORC1仍不清楚，由于细胞数量有限和发育异质性，这难以直接测试。尽管在NIH3T3细胞中异位表达的MORC1结合了转座子位点，但它并未显著改变转座子表达，可能是因为这些元件已经嵌入在抑制的异染色质中。因此，我们的数据并未直接证明MORC1介导的TRIM28招募足以建立新的转座子沉默。指导MORC1定位到特定转座子亚家族的机制尚未解决。KRAB-ZFPs是合理的候选者，但它们的参与尚未直接验证。确定上游靶向因子对于理解MORC1如何在生殖细胞中选择性地作用于年轻LINE-1和其他转座子亚家族至关重要。

资源可用性
如需更多信息和资源，请联系主要联系人Mikiko C. Siomi（[e-mail]）。

材料可用性
本研究生成的所有质粒和细胞系均可根据请求从主要联系人处获得，需签署完整的材料转让协议。

数据和代码可用性
- 本研究生成的所有数据集在发表时已公开。访问编号如下，并列在关键资源表中。
- 本研究生成的所有序列数据集已存放在Gene Expression Omnibus (GEO) 中，访问编号如下：GSE314168（来自naive NIH3T3细胞的RNA-seq）、GSE314169（来自表达3xFLAG-MORC1 WT或3xFlag-MORC1 ΔIDR-bpNLS的NIH3T3细胞的RNA-seq）、GSE314166（来自表达3xFLAG-MORC1 WT或3xFlag-MORC1 ΔIDR-bpNLS的NIH3T3细胞的MORC1 ChIP-seq）、GSE314170（来自表达3xFLAG-mCherry、3xFLAG-MORC1 WT或3xFLAG-MORC1 ΔIDR-bpNLS的NIH3T3细胞的TRIM28 ChIP-seq）以及GSE314165（来自表达3xFLAG-mCherry、3xFLAG-MORC1 WT或3xFLAG-MORC1 ΔIDR-bpNLS的NIH3T3细胞的ATAC-seq）。本研究生成的所有序列数据的详细信息和质量控制指标在表S2中提供。
- MS蛋白质组学数据已通过jPOST合作伙伴存储库存放在ProteomeXchange Consortium中，数据集标识符为PXD074028。
- 本文未报告原始代码。
- 如需重新分析本文报告的数据，可从主要联系人处获得额外信息。**化合物**
Sakura Finetek Japan（编号：45833）
Hoechst 33342（Lonza）
Cat# PA-3014（ISOGEN II）
NIPPON GENE（编号：311-07361）
TURBO DNase（Thermo Fisher Scientific）
Cat# AM2239（TruSeq stranded mRNA，Illumina）
Cat# RS-122-2103（NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit，New England Biolabs）
Cat# E7765（LtruChIP Chromatin Shearing Kit with Formaldehyde，Covaris）
Cat# 520154（Proteinase K，Roche）
Cat# 03115828001（NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit for Illumina，New England Biolabs）
Cat# E7645（SNextera DNA Library Prep Kit，Illumina）
Cat# FC-121-1030（MinElute PCR Purification Kit，Qiagen）
Cat# 28004（Trypsin/Lys-C Mix，Promega）

**商业试剂**
ChemiDoc XRS Plus System（Bio-Rad）
PCStage Top Incubator（TOKAI HIT）
STXG-WSKMX-SET（Branson）
Branson digital sonifier 250D-Advanced（Branson）
Branson digital sonifier SFX150（Branson）
P1CTK1000019-1（GL-Tip SDB，GL Sciences）
Nanoelectrospray ion source（Thermo Fisher Scientific）

**仪器与耗材**
C18 reverse-phase column（内径75 μm，长150 mm，Nikkyo Technos）

**数据来源**
Raw sequencing data（原始测序数据）
GEO: GSE314165, GSE314166, GSE314168, GSE314169, GSE314170
Raw mass spectrometry proteomics data

**参考文献**
jPOST: PXD074028（成人生殖细胞RNA-seq数据，Hasegawa等人）
GEO: GSE55060, GSE89502（Morc1 KO和杂交生殖细胞RNA-seq数据，Uneme等人）
GEO: GSE235429（Morc1 KO和杂交生殖细胞ChIP-seq数据，Uneme等人）

**实验模型**
**细胞系**
NIH3T3（来自RIKEN BioResource Research Center，编号：RCB2767，RRID: CVCL_0594）
Ddx4-Venus TG Mouse（Ogonuki等人）
AC57BL/6J, JmsSlc（N/）
Recombinant DNA（Caspex，Myers等人，编号：97421，RRID: Addgene_97421）
pEGFPC1（Abrisch等人，编号：141152，RRID: Addgene_141152）
pCMV-hyPBase（Yusa等人，N/）
Caspex-3xFlag-mCherry（本研究表明使用）
Caspex-3xFlag-Morc1 WT（本研究表明使用）
Caspex-3xFlag-Morc1 ΔIDR-bpNLST（本研究表明使用）
pEGFPC1-3xFlag-Morc1 WT（本研究表明使用）
pEGFPC1-3xFlag-Morc1 ΔIDR（本研究表明使用）
pEGFPC1-3xFlag-Morc1 bpNLS_m1（本研究表明使用）
pEGFPC1-3xFlag-Morc1 bpNLS_m2（本研究表明使用）
pEGFPC1-3xFlag-Morc1 ΔIDR-bpNLST（本研究表明使用）
pEGFPC1-3xFlag-mCherry-MVH（本研究表明使用）
pEGFPC1-3xFlag-NLS-mCherry-MVH（本研究表明使用）
pEGFPC1-mCherry-Trim28 WT（本研究表明使用）
pEGFPC1-mCherry-Trim28 ΔPHD（本研究表明使用）
pEGFPC1-mCherry-Trim28 ΔBROMO（本研究表明使用）
pEGFPC1-mCherry-Trim28 ΔNLST（本研究表明使用）
pEGFPC1-mCherry-Trim28 ΔNLSΔBROMO（本研究表明使用）
pEGFPC1-3xFlag-Morc2a（本研究表明使用）
pEGFPC1-3xFlag-Morc2b（本研究表明使用）
pEGFPC1-3xFlag-Morc3（本研究表明使用）
pEGFPC1-3xFlag-Morc4（本研究表明使用）
pEGFPC1-3xFlag-Morc1 3-IDR（本研究表明使用）
pEGFPC1-3xFlag-Morc1 3-CW/IDR（本研究表明使用）

**软件与算法**
STRING（版本12.0，Szklarczyk等人，RRID: SCR_005223；https://string-db.org/DISOPRED3）
Jones and Cozzetto（RRID: SCR_010248；https://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/c）
NLS Mapper（Kosugi等人，https://nls-mapper.iab.keio.ac.jp/cgi-bin/NLS_Mapper_form.cgi）
CLUSTAL Omega（版本1.2.4，Sievers等人，RRID: SCR_001591；https://www.ebi.ac.uk/jdispatcher/msa/clustalo）
Fiji（ImageJ，版本2.1.0/1.53c，Schindelin等人，RRID: SCR_002285；https://fiji.sc）
Proteome Discoverer 2.5（Thermo Fisher Scientific，RRID: SCR_014477）
Cutadapt（Kechin等人，RRID: SCR_011841；https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/SeqKit）
Shen等人（RRID: SCR_018926；https://bioinf.shenwei.me/seqkit）
FastQC（ARRID: SCR_014583；https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/）
Trim Galore（ARRID: SCR_011847；http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/）
Bowtie2（Langmead and Salzberg，RRID: SCR_016368；https://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml）
STAR（Dubin等人，RRID: SCR_004463；https://github.com/alexdobin/STAR）
FeatureCounts（Liao等人，RRID: SCR_012919；https://subread.sourceforge.net/featureCounts.html）
Picard（ARRID: SCR_006525；http://broadinstitute.github.io/picard）
Samtools（Danecek等人，RRID: SCR_002105；http://htslib.org/bam）
Coverage（Ramírez等人，RRID: SCR_016366；https://deeptools.readthedocs.io/en/develop）
MACS3（Zhang等人，RRID: SCR_013291；https://macs3-project.github.io/MACS/）
DESeq2（Love等人，RRID: SCR_015687；https://bioconductor.orgpackages/release/bioc/html/DESeq2.htm）
edgeR（Chen等人，RRID: SCR_012802；https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR）
BEDTools（Quinlan and Hall，RRID: SCR_006646；https://github.com/arq5x/bedtools2）
GenMap（Sedlazeck等人，RRID: SCR_005488；http://cibiv.github.io/NextGenMap/deepTools）
Dynabeads Protein G（Thermo Fisher Scientific，用于细胞质分离）

**其他工具**
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix（New England Biolabs，用于质粒组装）
Lipofectamine 2000（Thermo Fisher Scientific，用于转染）
piggyBac transposon系统（用于生成多克隆细胞系）
Puromycin（用于筛选细胞）
Doxycycline（用于诱导细胞表达）
CoIP buffer（用于免疫共沉淀）
Western blotting和银染试剂（Bio-Rad）
Immunofluorescence和荧光抗体（Thermo Fisher Scientific和Vector LABORATORIES）
Live-cell imaging设备（TOKAI HIT）珠子先用低缓冲液[0.1% SDS、1% Triton X-100、2 mM EDTA（pH 8.0）、150 mM NaCl和20 mM Tris-HCl（pH 8.0）清洗三次，然后用高缓冲液[0.1% SDS、1% Triton X-100、2 mM EDTA（pH 8.0）、500 mM NaCl和20 mM Tris-HCl（pH 8.0）清洗一次。免疫沉淀产物通过悬浮在直接洗脱缓冲液[10 mM Tris-HCl（pH 8.0）、5 mM EDTA（pH 8.0）、300 mM NaCl和0.5% SDS]中，在65°C下摇动15分钟进行洗脱。样品在37°C下用蛋白酶K处理6小时，然后在65°C下过夜反转交联。DNA通过乙醇沉淀提取。文库制备使用NEBNext Ultra Ⅱ DNA Library Prep Kit for Illumina按照制造商的说明进行。

ATAC-seq文库构建根据既定协议进行，但对本研究进行了轻微调整。在Dox诱导48小时后，收集表达3×Flag-mCherry、3×Flag-MORC1（WT）或3×Flag-MORC1 ΔIDR-bpNLS的NIH3T3细胞（每个反应1×10^5个细胞）。每种条件包括两个生物学重复。细胞在50 μL冰冷的裂解缓冲液中轻轻裂解以释放细胞核，随后将细胞核沉淀并转移到转座混合物中，该混合物由2×TD缓冲液（25 μL；Illumina）、TDE1转座酶（1.5 μL；Illumina）和无核酸酶的水（23.5 μL）组成。转座反应在37°C下进行30分钟。通过TDE1插入产生的DNA片段使用MinElute PCR Purification Kit（Qiagen）进行纯化。文库通过使用条形码引物集（0.125 μM）进行PCR扩增产生。在测序前，通过TapeStation分析片段大小分布来评估转座性能和文库质量。

对于蛋白质相互作用的分析，将与MORC1 WT有显著结合的蛋白质（与对照组相比，log2倍数变化>1且P值<0.05）以及SETDB1（UniProt访问ID：O88974）提交到STRING（版本12.0）中进行分析。随后，识别并提取与SETDB1相互作用的蛋白质。使用DISOPRED3通过PSIPRED服务器预测MORC1的IDRs。使用cNLS Mapper预测核定位信号（NLSs），截断分数为5.0。使用CLUSTAL Omega（版本1.2.4）和默认参数对小鼠MORC1–4氨基酸序列进行多序列比对。使用CLUSTAL Omega提供的邻接法生成系统发育树。对于核焦点分析，在Fiji（ImageJ，版本2.1.0/1.53c）中处理表达MORC1 WT的NIH3T3细胞和生殖细胞的图像。使用最大熵阈值方法对图像进行二值化，并使用 Analyze Particles功能检测每个焦点的面积。为了排除噪声，从后续分析中移除了面积小于或等于0.017 μm^2的对象。对于FRAP分析，在每个时间点使用Fiji量化漂白区域的荧光强度。将值标准化，使两个漂白前的帧的平均强度标准化为1，而漂白过程后立即的强度标准化为0。随后，使用SciPy（Python）中的curve_fit函数将标准化恢复曲线拟合到方程I(t) = Imax × (1 ? √ (τ / (τ + π t))) + C。

对于共免疫沉淀分析，使用Fiji量化每个条带的信号强度，并减去背景。

固定在珠子上的蛋白质在37°C下用200 ng的trypsin/Lys-C混合物（Promega）消化过夜。所得肽类使用GL-Tip SDB（GL Sciences）进行还原、烷基化、酸化和脱盐。沉淀物在SpeedVac浓缩器中干燥，并在0.1%三氟乙酸和3%乙腈（ACN）中复溶性。LC-MS/MS分析使用EASY-nLC 1200 UHPLC系统和配备纳米电喷雾离子源的Orbitrap Fusion质谱仪（Thermo Fisher Scientific）进行。肽类在直径75 μm、长度150 mm的C18反相柱（Nikkyo Technos）上分离，先使用4–32%的ACN梯度分离100分钟，然后增加至80%的ACN梯度分离10分钟，最后在80%的ACN梯度下保持10分钟。质谱仪以数据依赖模式操作，最大工作周期为3秒。MS1谱图的分辨率为其120,000，自动增益控制（AGC）目标为4e5，质量范围为375至1,500 m/z。HCD MS/MS谱图在线性离子阱中获取，AGC目标为1e4，隔离窗口为1.6 m/z，最大注射时间为35 ms，正常化碰撞能量为30。原始数据使用Proteome Discoverer版本2.5（Thermo Fisher Scientific，USA）和Sequest HT搜索引擎针对SwissProt数据库（限制为Mus musculus）进行搜索。搜索参数如下：（a）trypsin作为酶，允许最多两次切割失误；（b）前体质量容忍度为10 ppm；（c）肽片段质量容忍度为0.6 Da；（d）半胱氨酸的酰胺甲基化作为固定修饰；（e）蛋白质N末端的乙酰化和甲硫氨酸的氧化作为可变修饰。使用Percolator节点以1%的假发现率过滤肽类。使用Precursor Ions Quantifier节点进行无标签前体离子定量，并进行标准化，使得每个样本所有肽类的总和丰度值相同。原始LC-MS/MS数据在表S1中提供。

RNA-seq数据从WT NIH3T3细胞中获取后，使用Bowtie2以配对末端模式映射到小鼠基因组（mm10），并进行质量检查。保留唯一映射的读段，同时移除未映射的读段和与基因组黑名单区域（mm10-blacklist.v2）重叠的读段。然后使用featureCounts和参数-p -t exon -g gene_id计算基因外显子上的读段计数。从表达3×Flag-mCherry、3×Flag-MORC1 WT或3×Flag-MORC1 ΔIDR-bpNLS的Dox诱导NIH3T3细胞中获取的RNA-seq数据首先使用TrimGalore进行接头修剪。基因表达分析使用与WT NIH3T3细胞相同的流程处理修剪后的读段。生殖细胞RNA-seq数据来自Gene Expression Omnibus（GEO），访问号为GSE235429。使用Hisat2以配对末端模式和--dta选项将读段对齐到小鼠基因组（mm10），并使用Cutadapt去除接头后使用SeqKit修剪至90bp。成年生殖细胞RNA-seq数据来自Gene Expression Omnibus（GEO），访问号为GSE55060和GSE89502。使用Bowtie2和Cutadapt去除接头后，使用SeqKit将读段修剪至25bp，并使用SeqKit对齐到小鼠基因组（mm10）。移除与基因组黑名单区域（mm10-blacklist.v2）重叠的读段，并使用featureCounts和选项-p -t exon -g gene_id计算基因外显子上的读段计数。计算每个基因的转录本百万计数（TPM）以测量表达水平。对于转座子表达分析，按照先前研究中描述的流程进行后续操作。具体来说，使用STAR将修剪后的读段映射到小鼠基因组（mm10），参数如下：--runMode alignReads --outFilterMultimapNmax 5000 --outSAMmultNmax 1 --outFilterMismatchNmax 3 -outMultimapperOrder Random --winAnchorMultimapNmax 5000 --alignEndsType EndToEnd --alignIntronMax 1 --alignMatesGapMax 350 --seedSearchStartLmax 30 --alignTranscriptsPerReadNmax 30000 --alignWindowsPerReadNmax 3000 --alignTranscriptsPerWindowNmax 300 --seedPerReadNmax 3000 --seedPerWindowNmax 300 --seedNoneLociPerWindow 1000。使用featureCounts和参数-p计数配对末端片段和-M选项包括多映射读段，基于RepeatMasker（open-4.0.5）注释在亚家族级别总结转座子的读段计数。使用DESeq2根据复制计数矩阵识别两种条件下的差异表达转座子，并添加伪计数。使用默认的中值比率方法进行大小因子标准化，并使用DESeq2中实现的Wald测试检测差异表达。从Gene Expression Omnibus（GEO）访问号GSE235429获得Morc1 KO和Het生殖细胞的RNA-seq数据，并使用上述相同的流程进行转座子表达分析。

ChIP-seq和ATAC-seq分析中，使用Cutadapt去除ChIP-seq读段的接头，并使用SeqKit将读段修剪至75 bp。修剪后的读段使用Bowtie2以配对末端模式对齐到小鼠基因组（mm10）。ATAC-seq读段的处理方式相同，首先使用Cutadapt去除接头，然后使用Bowtie2以配对末端模式映射到mm10，并使用选项-N 1 -X 2000 --no-mixed --no-discordant。对于ChIP-seq和ATAC-seq的对齐读段，使用Picard去除重复读段，并仅移除基因组黑名单区域（mm10-blacklist.v2）内的HighSignal区域。使用Picard CollectInsertSizeMetrics评估ChIP-seq和ATAC-seq数据集的读段和文库质量。此外，使用ATACseqQC进行ATAC-seq特有的质量控制。相应的质量控制指标在表S2中总结。使用deepTools中的multiBamSummary BED-file函数和BEDTools的多重覆盖函数计算过滤后的转座子区域的重复相关性，并在自定义的50-kb基因组区间上使用该函数。然后，合并生物学重复的BAM文件，并使用deepTools的bamCoverage函数生成bigWig文件并进行CPM标准化。使用MACS3和参数-f BAMPE --nolambda --keep-dup all在合并的BAM文件上识别峰值。使用edgeR中的filterByExpr函数定义每个样本的富集峰值，ChIP-seq峰值的最低总计数为10，ATAC-seq峰值的最低总计数为50。基于Mus_musculus的GRCm38.102.gtf（来自https://asia.ensembl.org/Mus_musculus/Info/Index）识别21,846个常染色体和性染色体上的蛋白质编码基因。启动子定义为转录起始位点（TSS）周围±500 bp的范围。从RepeatMasker（open-4.0.5）获取mm10转座子参考注释，并移除标记为Simple_repeat、Low_complexity、Satellite、rRNA、snRNA、tRNA、scRNA和其他非转座子类别的条目。使用BEDTools中的intersect函数识别基因启动子或转座子与峰值之间的重叠。使用GenMap和选项-K 30 -E 2 -t计算基因组范围的映射能力，并使用map函数将GenMap bedGraph与转座子坐标相交得到每个转座子位点的平均映射能力。从Gene Expression Omnibus（GEO）访问号GSE235429获得H3K9me3和H3 ChIP-seq数据集，并进行如前所述的分析。ChIP-seq读段归一化为CPM，通过将H3K9me3 ChIP信号除以相应的H3 ChIP信号计算相对H3K9me3富集度。使用可视化使用归一化的H3K9me3 bigWig文件。

显微镜图像的定量和统计分析，包括MORC1核焦点的面积和FRAP实验中的荧光恢复，使用Fiji进行。所有统计分析均在Python中完成。使用的统计测试、独立样本或测量值的数量（n）以及任何误差条的定义在相应的图表图例中说明。使用双侧Mann–Whitney U测试评估非正态分布数据的两组比较，包括MORC1焦点面积和FRAP恢复时间常数（τ）。使用Spearman的秩相关系数评估ChIP-seq、ATAC-seq和RNA-seq的生物学重复之间的可重复性，以及样本之间的读段计数比较。使用单侧Fisher的精确测试评估指示的特征集之间的重叠的统计显著性。使用DESeq2分析转座子亚家族的差异表达。使用Benjamini–Hochberg方法调整p值以进行多重检验，并根据相应图表中指示的FDR阈值确定显著性。在箱形图中，箱的边界表示第25和第75百分位数，箱内的线表示中位数， whiskers表示最小和最大值，圆圈表示异常值。对于ChIP-seq、ATAC-seq和RNA-seq，每种条件分析两个生物学重复，FRAP恢复是从每个构建物的11个独立测量值中测量的。统计显著性在图表中如下表示：???p < 0.001。当提供确切的p值时，它们显示在相应的图表上方。

附加信息（4）：下载所有PDF（9.50 MB）文件S1（包含图S1–S5）、电子表格（788.25 KB）、表S1（原始LC-MS/MS数据）、电子表格（307.84 KB）和表S2（所有测序数据集的详细信息和质量控制指标）、电子表格（11.42 KB）和表S3（PCR引物和质粒构建）。