TRIM32通过调节TLR4的泛素化，调控结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）引起的焦亡（pyroptosis）和线粒体功能障碍

《Acta Histochemica》：TRIM32 regulates Mycobacterium tuberculosis-induced pyroptosis and mitochondrial dysfunction by regulating TLR4 ubiquitylation

　　

摘要

结核病（TB）由结核分枝杆菌（M.tb）引起，仍然是全球主要的健康威胁。E3连接酶的三部分基序（TRIM）家族在各种细胞过程中起着关键作用，然而TRIM32在结核病中的具体作用仍不甚明了。本研究探讨了TRIM32在M.tb感染中的功能及其机制。我们发现M.tb感染显著降低了小鼠巨噬细胞中的TRIM32表达水平，提示其可能在结核病进展中起调控作用。TRIM32抑制了NLRP3炎性小体的激活以及M.tb感染巨噬细胞的焦亡作用。此外，TRIM32的过表达减轻了线粒体功能障碍，表现为活性氧（ROS）生成减少，抑制了线粒体ROS（mtROS）并恢复了线粒体膜电位。重要的是，TRIM32直接与TLR4相互作用，并通过K48位点的泛素化促进其降解，这是蛋白酶体降解的关键过程。TRIM32对焦亡和线粒体功能障碍的抑制作用部分被TLR4的过表达所逆转，这证实了TLR4是TRIM32作用的关键介质。我们的研究结果揭示了TRIM32通过TLR4介导的泛素化，在M.tb感染巨噬细胞中对线粒体健康和焦亡的关键调控作用。此外，内源性TRIM32的沉默加剧了NLRP3炎性小体的激活、焦亡和线粒体损伤，而AAV介导的TRIM32过表达改善了肺部病变，降低了细菌负荷并提高了M.tb感染小鼠的存活率，但这些益处部分被TLR4的共同过表达所抵消。我们的发现表明TRIM32是结核病中巨噬细胞焦亡的候选调控节点，值得进一步的临床前评估。

引言

结核病（TB）是一种慢性呼吸道传染病，主要由结核分枝杆菌（M.tb）感染引起（Dheda等人，2016年；Smith，2003年）。在大约85%的病例中，结核病的主要受累器官是肺部，因为该疾病是通过吸入打喷嚏、咳嗽、说话或吐痰等活动释放的飞沫传播的（Pezzella，2019年）。肺结核可导致并发症，如咯血、脓肿形成和积脓（Singh和Tiwari，2015年）。此外，潜伏的M.tb感染可能在约10%的感染者中重新激活，这种状态可能持续多年而不表现出来（Thaiss和Kaufmann，2010年）。尽管医疗治疗的可及性有所提高，但耐药结核病的出现带来了新的挑战（Prideaux等人，2015年）。因此，亟需进一步研究驱动结核病发展的分子机制。

三部分基序（TRIM）家族包括一组多样的E3泛素连接酶，在包括炎症和抗病毒防御在内的多种生物过程中发挥着关键作用（Kimura等人，2017年；van Gent等人，2018年）。例如，在结核病中，TRIM27通过增强免疫炎症反应并促进JNK/p38信号通路介导的凋亡来限制M.tb在宿主细胞内的存活（Wang等人，2016年）。M.tb诱导的TRIM25上调促进了细菌的细胞内存活，通过调节p38 MAPK和p65 NF-κB信号通路（Liu等人，2020年）。先前的研究表明TRIM32可能在抗结核反应中起重要作用。例如，在M.tb感染后，TRIM32可通过泛素化调节与自噬相关的蛋白质，促进自噬体的形成，从而帮助清除细胞内病原体（Romagnoli等人，2023年）。TRIM32在多种细胞功能中起关键作用，如凋亡、生长、增殖、分化、蛋白质降解和先天免疫反应（Chen等人，2016年）。然而，TRIM32如何具体参与结核病的发展机制仍不清楚。

TLR4是Toll样受体（TLRs）家族的成员，在通过识别病原体相关分子模式（PAMPs）触发先天免疫反应中起着关键作用（Hu等人，2024年）。研究表明，TLR4的降解受泛素依赖的蛋白酶体途径（UPPs）控制（Wang等人，2018年）。泛素化是一种重要的翻译后修饰，其中泛素分子共价连接到目标蛋白质上，影响其稳定性、定位、功能和相互作用（He等人，2024年）。它在细胞信号传导、免疫反应和病原体防御中起着关键作用（Asaoka等人，2016年；Luo等人，2012年）。近年来，研究揭示了泛素化在结核病（TB）的发病机制和宿主免疫反应中的重要性。然而，TLR4泛素化在结核病感染中的具体作用仍不完全清楚，需要进一步研究。值得注意的是，几种TRIM家族的E3连接酶通过泛素化该途径的受体或适配器成分来抑制TLR驱动的炎症，TRIM32本身也被认为参与了先天免疫信号的调节（An等人，2026年；Wang等人，2023年）；然而，TRIM32是否直接针对TLR4，以及这种靶向作用是否在M.tb感染期间发生，尚未得到解答。因此，我们假设TRIM32通过促进TLR4的泛素依赖性降解来限制M.tb诱导的巨噬细胞焦亡，并通过体外增益和缺失功能实验以及体内感染模型验证了这一假设。

章节片段

细胞分离和培养

如先前所述（Han等人，2024年），从6-8周龄的雄性C57BL/6 J小鼠中分离出原代腹腔巨噬细胞。这些细胞在含有10% FBS的DMEM培养基中培养（5% CO₂；37 °C）。培养24小时后，去除非贴壁细胞。贴壁细胞被培养并视为原代小鼠腹腔巨噬细胞。Vector、TRIM32和TLR4过表达质粒由中国上海的Sangon Biotech公司设计和合成，并进行了实验。

M.tb感染巨噬细胞中TRIM32的表达下调

为了评估M.tb感染对TRIM32表达的影响，我们将小鼠巨噬细胞用M.tb H37Ra以10:1的MOI感染24小时。Western blot显示M.tb感染导致TRIM32 mRNA表达和蛋白质水平显著下降（图1A和B）。这些结果表明M.tb感染抑制了TRIM32的表达，提示TRIM32可能在调节巨噬细胞对M.tb的反应中起作用。

TRIM32调节M.tb诱导的小鼠巨噬细胞中的NLRP3炎性小体激活和焦亡

讨论

全面了解结核病的致病机制对于改进这种临床常见传染病的预防和治疗策略至关重要。先前的研究表明，TRIM32表达失调会促进巨噬细胞中的炎症反应（Romagnoli等人，2023年）。在这项工作中，我们发现TRIM32是一个关键调控点，可以防止M.tb感染期间过度的巨噬细胞死亡和炎症。我们证明了TRIM32

作者贡献

WZ和TZ设计了这项研究。MH和FZ进行了所有实验并分析了数据并准备了图表。MH和FZ起草了初稿。FZ和XZ审阅并修改了手稿。所有作者都阅读并批准了最终版本。

患者出版同意

不适用。

伦理审批

所有动物实验均经过无锡第五人民医院（隶属于江南大学）的机构动物护理和使用委员会（IACUC）的审查和批准（批准编号IA20240302），并且符合美国国立卫生研究院关于实验室动物护理和使用的规定以及中国有关实验动物伦理使用的国家指南。

资金支持

本研究得到了无锡卫生健康委员会医学关键战略项目的支持

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能影响本文报告工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

不适用。

魏 Zhao | 田甜 张 | 花萌 | 赵新国中国江苏省无锡市江南大学附属第五人民医院呼吸与重症监护医学科，邮编214000