FoxO转录因子通过调控Ass1协调尿素循环与糖异生

《iScience》：FoxO transcription factors coordinate the urea cycle and gluconeogenesis by controlling Ass1

　　

禁食期间氨基酸分解代谢需要协调的氮处置与葡萄糖生成，但将尿素循环与糖异生联系起来的转录逻辑仍不清楚。叉头框O（Forkhead box O, FoxO）转录因子调控禁食代谢，研究人员在此确定FoxO为精氨基琥珀酸合成酶1（argininosuccinate synthase 1, Ass1）的直接肝脏调节因子。在禁食小鼠中急性敲低肝脏FoxO1/3a可降低Ass1表达、降低血糖并改变尿素循环氨基酸，表现为精氨酸减少、鸟氨酸增加，即使在Klf15缺陷肝脏中亦然。Ass1沉默再现上述表型并损害来自丙酮酸和乳酸的葡萄糖生成，而Ass1过表达可恢复FoxO受抑肝细胞中的葡萄糖生成。机制上，研究人员在Ass1上游增强子内鉴定出功能性FoxO结合元件，并通过报告基因 assay、电泳迁移率变动分析（electrophoretic mobility shift assay, EMSA）、体内成像和染色质免疫沉淀（chromatin immunoprecipitation, ChIP）确认其禁食诱导活性。这些发现确立了KLF15非依赖的FoxO-Ass1轴，在禁食期间协调尿素生成与糖异生，并支持肝脏对营养缺乏的代谢适应。

研究背景与立项依据

长期以来，氨基酸不仅是蛋白质构成单位，更是代谢整合的关键介质。禁食状态下增强的蛋白水解供应氨基酸，其碳骨架进入糖异生，而脱氨产生的游离氨（NH₃）需经肝脏特异性尿素循环解毒为尿素排泄。尿素循环五个核心酶中，精氨基琥珀酸合成酶（ASS1）与精氨基琥珀酸裂解酶（ASL）除解毒功能外，还经延胡索酸盐生成参与糖异生，但这一双重角色在糖异生速率控制中常被忽视。目前仅知鸟氨酸转氨甲酰酶（OTC）受KLF15直接转录调控，更宽泛的营养缺乏下尿素循环协同诱导网络尚未阐明。FoxO转录因子在禁食能量代谢中具保守地位，既往研究提示FoxO-KLF15轴联系氨基酸驱动糖异生与葡萄糖驱动脂生成，但FoxO是否直接调控Ass1及如何功能耦合尿素循环与糖异生未知。该研究发表于《iScience》，旨在揭示禁食期肝脏对齐氮处置与能量生成的转录机制。

主要关键技术方法

研究以雄性ICR小鼠与Klf15^+/+/Klf15^?/? C57BL/6J小鼠为体内模型，经腺病毒介导shRNA敲低FoxO1/3a或Ass1、过表达显性负性FoxO1（FoxODN）及Ass1；原代肝细胞用于救援实验。体外采用HepG2细胞进行Ass1增强子荧光素酶报告assay与FoxO1/3a共转染。机制层面联合染色质免疫沉淀（ChIP）、CUT&Tag、电泳迁移率变动分析（EMSA）、JASPAR预测、体内IVIS荧光素酶成像及RT-qPCR。代谢表型通过24小时禁食、丙酮酸耐受试验（PTT）与乳酸耐受试验（LTT）、血浆与肝脏氨基酸定量（Hitachi L-8080）评估。

研究结果

FoxO转录因子在禁食肝脏中独立于KLF15调控尿素循环相关氨基酸代谢

在Klf15 WT与KO背景及ICR小鼠中，肝脏FoxO1/3a敲低均降低空腹血糖，血浆与肝脏精氨酸显著下降、鸟氨酸上升，天冬氨酸、瓜氨酸、尿素、NH₃无变；Klf15缺失本身不改变精氨酸/鸟氨酸。提示FoxO调控尿素循环相关氨基酸谱独立于KLF15。

肝脏FoxO转录因子在禁食时通过Ass1控制尿素循环

FoxO1/3a敲低或FoxODN过表达在Klf15 WT/KO中均显著降低Ass1、Pck1、G6pc mRNA，Arg1不变。ICR小鼠重复验证一致。表明Ass1是FoxO在禁食肝脏尿素循环中的直接下游节点，非KLF15依赖。

禁食期Ass1敲低再现FoxO敲低代谢表型

肝脏Ass1双shRNA敲低降低空腹血糖，血浆/肝脏精氨酸降、鸟氨酸升，天冬氨酸/瓜氨酸/尿素/NH₃不变，ASS1蛋白降，FoxO1/3a及其他尿素循环基因表达未变。证明Ass1介导FoxO对尿素循环氨基酸谱的调控。

肝脏FoxO信号与ASS1均为体内乳酸/丙酮酸糖异生所必需

PTT与LTT显示FoxO1/3a或Ass1敲低小鼠腹腔注射丙酮酸（2 g/kg）或乳酸（2 g/kg）后血糖升幅与曲线下面积均减。原代肝细胞中FoxODN抑葡萄糖输出，Ass1过表达救援至对照水平，伴Ass1 mRNA升、Pck1/G6pc部分降。说明ASS1经底物供应（延胡索酸→苹果酸→草酰乙酸）补偿FoxO驱动糖异生转录。

鉴定Ass1上游FoxO结合区

基于ChIP-Atlas（GSM3381273）锁定Ass1增强子，分段克隆荧光素酶报告显示全长、片段1及亚段1A响应FoxO1/3a；EMSA证实重组GST-FoxO1-DBD结合1A内BS1，突变探针无位移；突变BS1后荧光素酶激活消失。

所鉴定区域是肝脏Ass1禁食应答所需

腺病毒递送野生型/突变型FoxO BS-Ass1启动子-Luc至肝脏，IVIS显示野生型在24小时禁食后荧光活性较喂饲态显著升高，突变型无应答。证明该增强子位点介导禁食诱导的Ass1转录。

FoxO转录因子在禁食时结合肝脏Ass1增强子

ChIP显示禁食对比自由进食，FoxO1与FoxO3a在Ass1增强子BS富集显著增；Pck1/G6pc启动子为正对照，Ass1基因体为负对照。CUT&Tag在FoxO1/3a敲低下富集消除。核提取Western显示禁食核FoxO1/3a蛋白升。表明禁食核FoxO可用性直接刺激Ass1转录。

讨论与结论翻译

讨论指出，该研究鉴定FoxO作为Ass1直接调节因子的新角色，独立于KLF15并协调禁食期尿素循环氨基酸变化。Ass1敲低再现FoxO表型且Pck1/G6pc未变，提示ASS1经延胡索酸供碳而非仅转录偶联。临床如丙酮酸羧化酶缺陷与citrin（AGC2）缺陷印证尿素循环与糖异生双向偶联。局限在于未直接示踪ASS1源碳流经延胡索酸-苹果酸-草酰乙酸。

结论：本研究确定FoxO-Ass1轴为禁食期协调尿素生成与糖异生的转录机制。研究人员证明FoxO经功能性增强子元件直接调控Ass1，独立于KLF15，且ASS1为来自糖异生前体高效葡萄糖生成所需。通过确立ASS1为协调氮处置与糖异生碳流的功能介质，研究发现此前未认识的调控节点，整合了营养缺乏下肝脏氨基酸代谢与能量稳态。