《Algal Research》：Seasonal variation of eukaryotic communities in tertiary wastewater photobioreactors: associations with treatment performance
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•季节性环境变化塑造了废水光生物反应器中真核生物群落的结构。•夏季条件下小球藻属占据优势，磷的吸收量更高。•四枝藻属、双点藻属以及食藻变形虫是冬季和秋季的主要类群。•春季轮虫数量增多与铵盐去除效率的提高同时发生。•季节性探索性共现网络凸显了真核生物群落的变化。引言欧盟对城市废
• 季节性环境变化塑造了废水光生物反应器中真核生物群落的结构。
• 夏季条件下小球藻属占据优势，磷的吸收量更高。
• 四枝藻属、双点藻属以及食藻变形虫是冬季和秋季的主要类群。
• 春季轮虫数量增多与铵盐去除效率的提高同时发生。
• 季节性探索性共现网络凸显了真核生物群落的变化。
引言 欧盟对城市废水处理施加的措施显著改善了欧洲的水质[1]。这一目标的实现主要依赖于大量城市废水处理厂的部署，其中大部分基于活性污泥法。然而，为满足欧盟法规要求，大多数处理厂仍需增加三级处理以去除过剩的营养物质。但传统的三级处理能耗较高，会向大气中释放温室气体，并产生污泥等其他残留物，这引发了对此类过程可持续性的质疑[2]。随着欧盟致力于在2050年实现零污染环境，亟需更高效的可替代方案以取代当前使用的常规废水处理工艺。一种具有前景的方法是利用在光生物反应器（PBR）中培养的微藻。通过利用其光合作用活性改善水质，在废水中培养微藻还可实现营养物质的回收利用，并产生可作为生物燃料原料或可持续农业实践中使用的生物刺激剂的高价值生物量[3]、[4]。微藻系统可用于完全替代活性污泥或氧化塘，实现所谓的废水二级处理。在这种情况下，微藻、其他真核生物和细菌形成共生体，执行完整的水处理过程[5]。在三级处理中，它们负责去除上一级处理未去除的过剩营养物质、难降解有机污染物和金属[3]。PBR内的微生物群落在整体系统性能中起着至关重要的作用，影响着营养物质动态、有机质降解和出水质量[6]。另一方面，微生物群落的组成受到温度、光照强度、有机碳、氨和磷酸盐含量以及废水中污染物存在情况的影响，同时也受PBR设计的影响[7]、[8]、[9]。此外，光生物反应器的运行条件，如水力停留时间和污泥停留时间（HRT和SRT），也会影响共生体的组成，较长的SRT通常导致真核生物群落更加稳定、多样性较低，且由少数物种占主导[10]。尽管细菌和古菌一直是废水处理系统中大多数微生物研究的重点，但包括真菌、原生生物和微藻在内的真核微生物正日益被认为对这些生态系统的生态平衡和功能潜力具有重要贡献[11]。然而，光生物反应器中真核群落的多样性和功能作用仍知之甚少，只有少数研究采用宏基因组学方法研究了微藻系统，特别是那些在现实或大规模条件下运行的系统。事实上，由于真核DNA相对于原核DNA占主导地位、混合藻-细菌群落的复杂性以及许多藻类类群缺乏参考基因组等挑战，全面的宏基因组分析，包括宏条形码测序，仍然非常稀少[12]。生物反应器中的空间和时间异质性可能导致微生物表示不均匀，而短期采样往往忽视了稀有但具有重要功能的类群[13]。此外，由于不同类群的细胞覆盖结构存在差异，DNA提取效率在各类群之间存在差异，藻类色素或多糖通常会抑制下游反应，引入定量偏差[14]。这些技术难题因参考数据库中藻类和共生微生物的覆盖范围有限而加剧，导致未分类读段比例高和组装碎片化[12]、[14]。最后，将功能基因与其宿主类群相关联并推断定量的生态互作仍然是主要的解释性挑战[15]。综上所述，这些因素限制了宏基因组学在工程化藻类系统中全面解析微生物多样性和代谢网络的能力。尽管如此，宏基因组学分析仍提供了强大的工具，用于探索复杂环境中微生物群落的生物多样性和代谢能力，允许对原核和真核生物进行全面研究[16]。
在本研究中，我们采用基于18S rRNA基因的宏条形码测序技术，研究了在真实室外条件下，用于城市污水处理厂二级出水三级处理的微藻光生物反应器中的真核生物多样性。通过表征真核群落（包括微藻及其潜在捕食者）的分类组成，我们旨在加深对季节性群落动态及其与废水处理性能关系的理解，并为优化PBR以提高效率和可持续性提供见解。实验持续一年，覆盖不同季节，以评估温度、光照强度和降雨的季节性变化影响，这些因素可能对微生物丰度产生重大影响，从而影响微生物群落的组成。这是一项长期时间序列研究，有助于克服上述宏基因组学研究的瓶颈之一。由于不同季节环境条件不同，预期各季节的生产力也不同，因此每个季节实验中采用了不同的水力停留时间。并行研究（已在其他地方发表）表征了所产生生物质产生沼气的可行性以及系统去除废水中过剩营养物质和药品的效率[3]、[4]、[17]。因此，本工作中呈现的唯一新数据集是对真核群落的18S rRNA宏条形码测序分析。营养物质去除效率、生物量组成和厌氧消化性能在此作为背景性能变量，来源于之前在同一实验活动中发表的研究。在此，我们将这些结果与真核群落的组成联系起来，为微藻基础和三级废水处理的变化提供了新的见解。
章节摘录 微藻光生物反应器 本研究使用的微藻光生物反应器是由Bluemaer, S.A.（葡萄牙波尔图）开发的新型GreenDune光生物反应器。反应器呈棱柱形，总体积为480 L，顶部开放，占地面积约1 m2。PBR最高点的水柱高度约为90 cm，最低点为10 cm。在本实验中，反应器以3个一组串联放置，总体积为1440 L（图1）。光生物反应器并未
结果与讨论 每个样本对应的非生物条件（温度和pH）、营养物质去除以及沼气和甲烷生产测量数据作为补充材料展示（表S1）。经质量控制后，测序共产生1,137,300个读段，分布在223个ASV上。
结论 本研究采用18S rRNA宏条形码测序方法，表征了在室外条件下运行的微藻光生物反应器中，用于城市污水处理厂二级出水三级处理的真核生物多样性。跨不同季节开展的研究数量有限，因此涵盖了全范围的气候波动和出水组成变化。此外，为评估运行
CRediT作者贡献声明 Tania Aires： 撰写–初稿、验证、数据整理。Aschwin H. Engelen： 撰写–审阅与编辑、撰写–初稿、数据整理。Etiele Greque de Morais： 方法、调查、形式分析、概念化。José Carlos Marques： 调查、形式分析。Jo?o Varela： 撰写–审阅与编辑、撰写–初稿、方法、调查、经费获取、数据整理、概念化。Luísa Barreira： 撰写–审阅与编辑、撰写
利益冲突声明 作者声明他们没有任何已知的竞争性财务利益或个人关系，这些情况可能会影响本文所报告的工作。
致谢 本研究是GreenTreat项目的一部分，获得了葡萄牙
科学与技术基金会 、
CRESC-Algarve 和
欧洲区域发展基金 （ERDF）计划（PTDC/BTA-BTA/31567/2017；ALG-01-0145-FEDER-031567和POCI-01-0145-FEDER-031567）的资金支持。该工作还通过合同UID/04326/2025（DOI doi:
10.54499/UID/04326/2025 ）、UID/PRR/04326/2025（DOI doi:
10.54499/UID/PRR/04326/2025 ）从
FCT ——科学与技术基金会获得了额外资金。
Tania Aires|Aschwin H. Engelen|Etiele Greque de Morais|José Carlos Marques|Jo?o Varela|Luísa Barreira
