基于浓缩RNA的分子拥挤机制及其在提升RNA适配体性能中的应用

《Analytica Chimica Acta》：Mechanisms and Applications of Condensed RNA-Based Molecular Crowding on Enhancing RNA Aptamer Performance

　　

摘要

背景

RNA适配体是生物传感中具有前景的识别生物受体，但由于结合亲和力有限、热稳定性差以及易受核酸酶降解的影响，其实际应用受到严重限制。由液-液相分离驱动的细胞内分子拥挤环境可以重塑RNA的构象并改善生物分子的功能，这激发了构建人工浓缩RNA系统以解决RNA适配体在食品病原体检测中的性能瓶颈。在这项工作中，我们设计了一种基于CUG三核苷酸重复序列的浓缩RNA平台，并与阳离子聚L-赖氨酸（Poly-L-Lys）结合使用，以提高针对金黄色葡萄球菌（S. aureus）的RNA适配体的检测性能，该细菌是重要的食品污染物。

结果

在体外成功制备了具有异质空间结构的非空腔RNA浓缩物。与未浓缩的适配体相比，浓缩RNA的结合亲和力提高了22.04%，熔化温度提高了11.63%，并且对核酸酶的抵抗力也得到了增强。机制研究表明，分子拥挤重新排列了适配体的二级结构，将结合热力学从熵驱动转变为焓驱动，并加速了目标结合的动力学。将其整合到pH敏感的比色检测方法后，全面评估了包括灵敏度、线性动态范围、检测限和重现性在内的关键分析性能指标。该传感器的灵敏度为每log₁₀(CFU·mL^-1 0.06吸光度，线性动态范围为10²–10⁸ CFU·mL^-1，检测限为236 ± 43 CFU·mL^-1

意义

这项工作建立了一种可行的分子拥挤工程策略，用于提升RNA适配体的性能。这种浓缩RNA传感平台为食品安全监测提供了可靠的分析工具，并为设计下一代基于核酸的生物传感器开辟了新途径。

引言

适配体是能够通过形状互补性、π-π堆叠、范德华力、氢键和静电相互作用[1],[2],[3],[4],[5]特异性结合其目标的短链DNA或RNA序列。它们可以用于检测食品中的有害物质，如致病细菌（例如沙门氏菌[6]、大肠杆菌 O157:H7 [7]）、农药和兽药残留（例如有机磷农药[8]、磺胺类药物[9]）、生物毒素（例如黄曲霉素[10]、氧化皮革素[11]）以及非法添加剂（例如三聚氰胺[12]、苏丹红[13]）。这些适配体常被集成到荧光传感器[14]、电化学传感器[15]和比色传感器[16]等检测平台中。然而，与更为成熟和稳定的检测技术[17],[18]相比，基于RNA适配体的生物传感器存在结合亲和力有限、易降解等缺点[19],[20]，因此提高其亲和力和稳定性对于改善检测性能至关重要。

RNA适配体的性能受其折叠结构的控制，而这一过程对周围分子微环境非常敏感[21]。研究表明，天然细胞通过将功能性RNA封装在囊泡中，提供了空间受限、分子拥挤的环境，从而稳定结构、促进折叠并增强功能活性[22]。这种环境与传统检测中常用的稀释溶液系统有根本不同，主要体现在以下几个方面：分子拥挤通过体积排除效应增加了RNA的有效浓度，加速了其折叠；同时，降低的水活度、升高的局部粘度和改变的离子分布共同影响了RNA的稳定性、构象动态和与目标的结合亲和力[23],[24],[25]。因此，设计人工分子拥挤系统对于提升RNA适配体在食品检测中的性能至关重要。

通过相分离，无膜细胞器可以将蛋白质和RNA从稀释溶液中浓缩到拥挤的微环境中[26],[27]。许多细胞内的三核苷酸重复扩展已被证明可以触发RNA相分离并在活细胞中形成浓缩物[28],[29],[30]。研究人员利用三核苷酸重复扩展作为基因编码的相分离驱动因素，构建了人工RNA浓缩物，以空间组织内源生物分子并调节细胞反应[31],[32]。然而，在食品检测应用中，适配体是在细胞外环境中发挥作用，而不是在细胞内环境中。因此，除了三核苷酸扩展外，还需要一种诱导剂来模拟细胞内环境并促进相分离。赖氨酸是一种在生理条件下带正电的必需氨基酸，在无序蛋白质区域中含量丰富，它在形成蛋白质和核酸浓缩物中起着关键作用[33]。聚L-赖氨酸（Poly-L-Lys）是一种广泛用于体外与相反电荷的核酸相互作用的阳离子多肽。阳离子和阴离子电荷的相互中和显著减少了颗粒间的静电排斥，使得范德华相互作用和氢键等吸引性分子力占主导地位，从而介导相分离和浓缩物的组装[34],[35],[36],[37]。然而，基因编码的人工浓缩RNA在提升RNA适配体检测性能方面的应用尚未得到充分探索。在这项研究中，引入了一种新的浓缩RNA系统来解决这一不足。

CUG三核苷酸重复序列被用作通用的自调节标签，并与之前报道的一种特异性结合金黄色葡萄球菌（S. aureus）细胞壁上的 teeichoic 酸的RNA适配体[38]融合，从而实现对该细菌的识别。S. aureus是一种常见的食品污染物，可污染食品并产生毒素，导致食物中毒，因此快速检测其存在至关重要[39]。这种融合构建与Poly-L-Lys协同使用，用于构建浓缩RNA系统。CUG三核苷酸重复序列驱动相分离，并将RNA适配体招募到浓缩物中，在那里拥挤的受限环境调节了其在检测系统中的结合亲和力和稳定性。为了验证RNA聚集体在本研究中的应用价值，将其应用于pH敏感的比色方法[40]来检测食品样本中的S. aureus。这进一步证明了RNA浓缩系统有效提升了RNA适配体的性能。通过引入这种限制RNA适配体的新概念，预计这种诱导拥挤的方法将为生物分子检测开辟新的途径。

章节片段

浓缩RNA系统的构建与表征

为了在体外建立浓缩RNA适配体系统，本研究首先使用CUG重复序列[33],[41]设计了一个相分离标签，并将其与针对S. aureus的RNA适配体融合。然后在Poly-L-Lys的诱导下形成了分子拥挤环境[34],[35]。具体步骤如下：合成的2 μM n×CUG标记的RNA适配体（序列：GGG AGU UUU GAU ACG GCU UCA UGC AGU AAU GUU UUU AU [38]，其中包含31个CUG重复序列（之前

浓缩RNA适配体系统的构建与表征

为了初步验证RNA聚集体的形成，比较了带有CUG重复标签的RNA适配体和未标记的RNA适配体在添加相同浓度Poly-L-Lys后的浑浊度。带有CUG重复标签的RNA适配体显示出明显的更高浑浊度（图1a），其颗粒大小也增大（图1b）。随后，两种FAM荧光标记的RNA适配体都进行了荧光成像

结论

本研究成功构建了一种基于CUG重复序列和Poly-L-Lys协同作用的体外浓缩RNA适配体系统，为RNA适配体提供了一个有效的分子拥挤工程平台。该系统形成了具有特定空间结构的非空腔浓缩物，显著提升了浓缩RNA适配体对S. aureus的结合亲和力、热稳定性和酶抗性，同时减少了其对Mg²⁺的依赖性，并保持了高

CRediT作者贡献声明

张宏岩：撰写 – 审稿与编辑、监督、资源获取。王思琪：撰写 – 原稿撰写、可视化、方法学设计、概念构思。焦玉茹：撰写 – 审稿与编辑、监督、项目管理、正式分析

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

数据可用性

本文所述研究未使用任何数据。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（重点计划，项目编号U22A20550）的支持。

王思琪|焦玉茹|张宏岩山东省新兴污染物风险预防与控制重点实验室，山东师范大学生命科学学院，济南250014，中国