《Analytica Chimica Acta》：Spatial Organization of Glucose Oxidase and Catalase in Layered Polyethylenimine Coated Carbon Nanotube Electrodes Affects Coupled Reaction Kinetics and Oxygen Recycling in Glucose Biosensors
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摘要H2O2 的积累通常会降低基于葡萄糖氧化酶（GOx）的葡萄糖生物传感器的灵敏度和稳定性。这项工作使用层层构建法（CNT/PEI/GOx；CNT/PEI/(GOx–Cat)；CNT/PEI/GOx/PEI/Cat；CNT/PEI/Cat/PEI/GOx）评估了四种碳纳米管（
摘要
H2O2 的积累通常会降低基于葡萄糖氧化酶（GOx）的葡萄糖生物传感器的灵敏度和稳定性。这项工作使用层层构建法（CNT/PEI/GOx；CNT/PEI/(GOx–Cat)；CNT/PEI/GOx/PEI/Cat；CNT/PEI/Cat/PEI/GOx）评估了四种碳纳米管（CNT）和聚乙烯亚胺（PEI）基生物催化剂配置，以调节 H2O2 扩散路径和通过过氧化氢酶（Cat）再生 O2。伏安分析和安培分析在 0.1 M 磷酸盐缓冲盐水（pH 7.4，有氧条件）下，相对于 Ag/AgCl 的电位为 -0.45 V 时进行。最佳配置为 CNT/PEI/GOx/PEI/Cat，表现出 Jmax 为 22.0 μA·cm-2， 为 6.55 mM，灵敏度为 3.34 μA×cm-2×mM-1，以及检测限（LOD）约为 44.84 μM。该结构显示出 16.47 pM·cm-2 的活性酶覆盖率（作为 FADH2），并在第四个循环中保持约 90% 的信号保留，表明在安培条件下，速率限制因素受 H2O2 的生成、扩散和转化以及 O2 的可用性控制，而不是完全由直接电子转移（DET）决定。将过氧化氢酶定位为 GOx 上方的最顶层（与 PEI 隔离）能有效抑制电极附近的 H2O2 积累，同时再生局部 O2，从而优化催化电流和稳定性。该配置还在含有常见电活性干扰物的加标溶液中实现了最准确的葡萄糖回收率（平均误差～3%），确认了其用于复杂样品分析的实用可靠性。这些结果为开发更敏感和更具韧性的葡萄糖生物传感器提供了结构化框架。
引言
基于葡萄糖氧化酶（GOx）的葡萄糖传感器一直可靠地用于准确测量葡萄糖，因为 GOx 仅与葡萄糖反应并产生清晰的电信号（Guoqiang 等人，2025 年）。GOx 利用氧气驱动反应将葡萄糖转化为其他物质，并产生葡萄糖酸内酯和过氧化氢（H2O2）作为副产物（Juska & Pemble, 2020）。传感器上由 H2O2 变化产生的电信号通常随葡萄糖水平升高而增加（Mohamad Nor 等人，2022 年）。然而，如果 H2O2 积累过多，可能会干扰信号，伤害酶，并损坏传感器，从而降低准确性（Cui 等人，2019 年；K. Sun 等人，2021 年）。
为了克服这些局限性，研究集中在开发利用碳纳米管（CNTs）的电极材料和酶固定化框架上，碳纳米管具有高导电性和大表面积（Gupta 等人，2022 年；T?lmaciu & Morris, 2015 年）。CNTs 实现了 GOx 的黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）活性位点与电极之间的直接电子转移（DET），同时也增强了酶固定化（Jayakumar 等人，2021 年）。将 CNTs 与聚乙烯亚胺（PEI）结合进一步增强了电极与酶之间的静电相互作用，保持构象稳定性，并缩短电子转移距离（Christwardana 等人，2017 年；Liang 等人，2022 年）。一种有前景的最新方法是纳入酶过氧化氢酶，它将 H2O2 分解为 H2O 和 O2（Kuwahara 等人，2018 年）。过氧化氢酶不仅防止 H2O2 积累并保护 GOx 免受失活，还能再生氧气，这对维持葡萄糖氧化至关重要，特别是在氧气有限的条件下（Berketa 等人，2023 年）。
虽然 GOx 和过氧化氢酶显示出显著的协同潜力，但设计双酶生物传感器架构仍然具有挑战性。主要问题是在电极表面排列这两种酶。传统方法通常在单一基质中共固定 GOx 和过氧化氢酶（Christwardana 等人，2017 年；Cui 等人，2019 年）。然而，这使得评估单一酶放置对系统动力学和电化学性能的影响变得复杂（Mojica & Kalcher, 2007 年）。层层组装，其中组件依次固定，提供了对酶定位的更大控制（Gao 等人，2011 年；W. Zhang 等人，2004 年）。这种配置改变了 H2O2 和 O2 的扩散路径、酶反应动力学和电子转移效率。最终，它影响生物传感器的灵敏度、线性和稳定性（J. Zhang 等人，2007 年）。过氧化氢酶的定位至关重要。它可以防止有害的 H2O2 积累并支持 GOx 稳定性。然而，将过氧化氢酶放置在靠近电极处可能会降低依赖 H2O2 的安培信号或限制催化所需的氧气（Berketa 等人，2023 年；Bouyahia 等人，2011 年）。
基于这种空间排列原理，在将层层策略应用于 GOx-过氧化氢酶系统方面仍然存在重要空白。以往的研究通常集中在单一基质内的共固定或固定的多层配置（Christwardana 等人，2017 年；Lin 等人，2022 年），而反转 GOx 和过氧化氢酶相对位置对 H2O2/O2 传输、电子转移特性和生物传感器性能的影响很少被系统地研究。此外，以往的研究通常分别评估电化学动力学或操作稳定性（Kant 等人，2014 年；Nestler 等人，2015 年），限制了直接评估酶的空间组织如何影响整体生物传感器行为。
为了解决以前研究中确定的空白，系统性策略涉及进行基于 CNT/PEI 的电极设计的受控比较，使用 GOx 和过氧化氢酶进行酶固定化。唯一的变量是层层配置中的酶排列顺序，过氧化氢酶或 GOx 定位为最外层。这种方法能够确定过氧化氢酶相对于 GOx 和电极放置之间的因果关系，以及 H2O2 降解、O2 再生和电子转移过程的效率（Christwardana 等人，2017 年；Yan 等人，2020 年）。具体来说，预计将过氧化氢酶定位在最外层将减少 H2O2 积累并防止表面污染（Sharma 等人，2023 年），而将其放置在底层预计将增强 GOx 附近的 O2 再生，从而增加催化周转（Wong 等人，2008 年）。此外，将 PEI 作为间隔层纳入使其作为间隔物和扩散屏障的作用得以评估，从而影响传质和电荷转移电阻（Nguyen 等人，2019 年）。
因此，本研究提供了四种基于 CNT/PEI 的架构的受控比较，包括一个共固定 GOx-Cat 配置和三种具有不同 GOx/过氧化氢酶序列的层层排列。这种集成方法将酶的空间组织与电化学参数、源自 Laviron 的电子转移速率常数（ks）、葡萄糖传感性能、四个循环的可重用性以及八周的长期存储稳定性联系起来。因此，本研究旨在建立多层葡萄糖生物传感器中酶定位的机制设计原则，而不是仅仅关注性能优化。
章节片段
材料
来自黑曲霉的葡萄糖氧化酶（GOx）和来自牛肝的过氧化氢酶（Cat）购自陕西先锋生物科技有限公司（中国），作为主要酶。多壁碳纳米管（MWCNT）作为基础材料，而聚乙烯亚胺（PEI）用作粘合剂；两者均购自 Sigma-Aldrich（美国圣路易斯）。磷酸盐缓冲盐水（PBS, pH 7.4）在酶固定化过程中用作缓冲液。
生物传感器的结构和理化特性
SEM 成像显示，酶堆叠顺序强烈影响表面形态。CNT/PEI/GOx/PEI/Cat 电极显示出粗糙、异质的宏观结构，伴有不规则的团聚体，与过氧化氢酶由于其异质表面电荷和多聚体结构而在聚电解质界面上倾向于聚集的情况一致。相比之下，CNT/PEI/Cat/PEI/GOx 显示出更光滑、更连续的涂层，反映了 GOx 到 PEI 上更均匀的静电吸附
结论
CNT/PEI/GOx/PEI/Cat 架构实现了催化活性、传质和操作稳定性的有效平衡。在 0.1 M PBS（pH 7.4，空气，-0.45 V vs Ag/AgCl）中，它提供了 Jmax 为 22.0 μA·cm-2， 为 6.55 mM，灵敏度为 3.34 μA×cm-2×mM-1，以及检测限（LOD）约为 44.84 μM。相对于 CNT/PEI/GOx，Jmax 增加了～85%，LOD 降低了～72%，确认了由 PEI 屏蔽的外层 Cat 在分解 H2O2 和再生 O2 以维持 GOx 周转中的关键作用。
CRediT 作者贡献声明
Lina Mahardiani: 写作 – 审查和编辑，验证。 Khanifa Aulia Rakhma: 写作 – 原稿，可视化，调查，形式分析，数据管理。 Marcelinus Christwardana: 写作 – 审查和编辑，写作 – 原稿，验证，监督，资源，资金获取，概念化。 Cepi Kurniawan: 写作 – 审查和编辑，验证，监督，概念化。 K. Khoirunissa: 写作 – 原稿，调查，形式分析，数据管理
利益冲突声明
? 作者声明他们没有任何已知的竞争财务利益或个人关系，这些可能会影响本文中报告的工作。
致谢
作者感谢通过 2025 年印度尼西亚协作研究（RKI）计划由 迪波内戈罗大学 提供的财政资助 [合同号 325-11/UN7.D2/PP/V/2025]。
Marcelinus Christwardana|Khanifa Aulia Rakhma|K. Khoirunissa|Cepi Kurniawan|Lina Mahardiani
迪波内戈罗大学理学院化学系，印度尼西亚三宝垄，50275
