一种适配体/磁性与微阵列免疫探针（MIP）双重识别的夹心生物传感器，用于食品中卡那霉素的快速且可回收的分离检测

《Analytica Chimica Acta》：Aptamer/magnetic-MIP dual-recognition sandwich biosensor for rapid and recyclable determination of kanamycin in food

　　**摘要**
**背景**
快速而精确地监测抗生素残留是食品安全和诊断科学的基石。本文报告了一种高性能的双识别夹心型荧光生物传感器，该传感器通过将基于Fe3O4@UiO-66的分子印迹聚合物（FUMIP）与荧光标记的适配体探针（Apt-FAM）相结合，实现了对卡那霉素（KANA）的超灵敏检测。

**结果**
该设计的核心在于FUMIP框架提供的受限微环境，这种环境通过协调的硼酸亲和力和氢键作用促进了KANA的选择性预浓缩。这种界面富集显著提高了随后Apt-FAM探针的识别效率，形成了一个稳定的夹心结构，其灵敏度比本研究构建的单识别控制系统提高了156倍。FUMIP组分的印迹因子为5.19，吸附容量为45.11 mg/g，即使在复杂基质中也能确保高保真度的靶标捕获。优化的生物传感器能够在30分钟内完成快速定量，检测限达到0.0032 ng/mL，并在宽广的线性范围（0.01-1000 ng/mL）内具有出色的检测效果。相比之下，单识别传感器的线性范围为1-500 ng/mL，检测限为0.5010 ng/mL。此外，该传感器具有良好的重复使用性（20次循环后信号保留率为70%），以及很高的实际可靠性，在真实食品样品中的回收率为98.0%-106.2%。

**意义**
这项工作不仅为KANA的监测提供了一个先进的平台，还通过利用合成受体和生物受体之间的协同作用，提供了一种通用策略，用于超灵敏地检测小分子污染物。

**引言**
卡那霉素（KANA）是一种广谱氨基糖苷类抗生素，由链霉菌属产生，广泛用于预防和治疗牲畜、家禽和水产养殖中的细菌感染[[1], [2], [3]]。然而，其残留物可能通过食物链的积累对人类健康造成肾毒性、耳毒性和细菌耐药性等潜在威胁[4]。因此，建立高效的KANA检测方法对于确保食品安全和降低环境风险具有重要意义[5,6]。
目前，高效液相色谱（HPLC）和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）等常规检测方法具有高灵敏度[7,8]。然而，这些技术需要繁琐的样品预处理、昂贵的仪器，并且依赖专业操作人员，不适合快速现场检测[9]。
荧光生物传感器因其操作简单、响应迅速和相对低成本而受到广泛关注。它们的检测性能很大程度上取决于识别元素的选择和优化，以及信号放大策略的改进[10,11]。常用的识别材料包括抗体、适配体（Apts）、分子印迹聚合物（MIPs）和酶[[12], [13], [14], [15], [16]]。其中，MIPs作为仿生抗体，不仅具有与抗体相当的识别能力，还具有成本更低和稳定性更高的优势[17]。MIPs具有与靶标分子在空间构型和官能团方面互补的特异性空腔，通过模板-单体聚合后去除模板制备而成。它们能够在复杂基质中高度选择性地识别靶标分析物[18,19]。同时，在分子印迹系统中，印迹空腔可以富集模板分子。这种将靶标限制在MIPs表面有限空间内的能力有效限制了分子的扩散和相互作用[[20], [21], [22]]。这种限制效应显著增加了靶标在识别位点附近的局部浓度，从而提高了主客体相互作用的概率，改善了识别效率[23,24]。因此，印迹层在检测过程中有助于靶标的富集和浓缩[25]。
MIPs的印迹效率和识别性能不仅受合成过程的影响，还直接影响其支撑材料的结构特性[26,27]。理想的支撑材料应具有较大的比表面积、结构稳定性以及丰富的表面官能团[28]。金属有机框架（MOFs）因其高孔隙率和可调结构而被广泛认为是MIPs的理想支撑材料[[29], [30], [31]]。其中，基于锆的MOF材料UiO-66由Zr6O4(OH)4团簇与对苯二甲酸连接而成。其高配位数赋予了出色的化学和机械稳定性，其分层多孔结构为MIPs提供了足够的印迹位点[32]。此外，UiO-66表面的极性基团可以通过多种相互作用结合核酸分子，其氨基基团可用于固定4-羧基苯硼酸（4CPBA），并通过可逆的硼酸酯键与羟基进一步提高印迹特异性[33]。复合材料Fe3O4@UiO-66通过将磁性Fe3O4与UiO-66结合，不仅利用了UiO-66的大比表面积增加了MIPs的印迹面积，还实现了快速的磁分离和材料回收。与传统基于UiO-66-NH2的适配体传感器不同（在这些传感器中，MOFs主要作为适配体固定或信号放大的支撑基质[34,35]），本研究中的Fe3O4@UiO-66作为一个多功能平台，结合了磁响应性、基于分子印迹的选择性识别以及通过丰富的可访问识别位点的靶标富集。然而，仅基于MIPs的识别仍可能受到结构相似化合物的干扰[36]。
相比之下，适配体（Apts）是通过指数富集系统进化得到的单链核酸，能够通过折叠成与靶标分析物精确匹配的三维构象来高亲和力识别靶标[[37], [38], [39]]。适配体具有易于合成、优异的稳定性、高结合亲和力、宽温耐受性，其核酸骨架可以方便地修饰荧光基团，有利于构建信号探针[40]。近年来，基于适配体的荧光传感器在小分子检测中显示出巨大潜力。它们的高度特异性识别机制与MIPs功能互补[22,41]。迄今为止，已开发了多种MIP-Apt双识别系统以提高传感选择性[42]。然而，将MIP介导的靶标预富集、空间协同的MIP-Apt夹心识别、磁分离和材料可回收性相结合的集成传感平台的构建仍然很少被探索。将磁性Fe3O4@UiO-66纳入夹心型MIP-Apt架构提供了一种集成策略，以增强靶标的可访问性、加速分离并提高分析可靠性[43]。因此，通过结合MIPs和Apts构建双识别系统是一种有效的方法，可以提高传感器的抗干扰能力，减少假阳性和假阴性结果，为KANA的高选择性检测提供了可靠的方法[44,45]。
本研究开发了一种基于双识别的信号关闭型夹心型荧光生物传感器。与之前报道的基于UiO-66-NH2的KANA检测适配体传感器不同，所提出的策略不仅依赖于适配体介导的识别过程，还引入了磁性分子印迹界面以实现靶标富集和初步选择捕获。基于Fe3O4@UiO-66的分子印迹聚合物（FUMIP）和荧光标记的适配体探针（Apt-FAM）作为双识别元素，形成稳定的夹心结构。印迹空腔是通过多巴胺（DA）的自聚形成的，无需额外的引发剂或交联剂。得益于FUMIP的多孔结构和磁富集能力，KANA分子被迅速捕获在印迹空腔中。这种富集提高了局部靶标浓度，并促进了后续的适配体-靶标相互作用。顺序识别过程形成了夹心型结构，其中MIP富集和适配体识别协同作用提高了分析准确性。磁性FUMIP不仅可以将富集在FUMIP上的KANA-Apt-FAM从溶液中分离出来，导致荧光信号变化，还能实现快速的材料回收。此外，FUMIP的磁性可回收性为重复使用和实际应用提供了额外的优势，比传统的非磁性识别平台更具优势。这种双识别生物传感器为食品样品中抗生素残留的快速监测提供了一种有前景的策略。

**材料与仪器**
本研究中使用的寡核苷酸序列由中国上海Sangon Biotech有限公司合成、修饰和纯化。用于KANA的适配体序列为5′-TGG GGG TTG AGG CTA AGC CGA-3 [42,46]，相应的cDNA序列为5′-CGG CAA TCC CTC AAC CCC C-3′。其他材料和仪器的详细信息见支持信息中的S1部分。

**材料合成**
Fe3O4、Fe3O4@UiO-66、FUMIP的合成详细信息见支持信息中的S2部分。

**具有协同FUMIP和Apt-FAM识别的磁性夹心型荧光传感器的制备**
图1说明了磁性分子印迹材料的制备过程和夹心型荧光传感器的检测原理。在分子印迹过程中，使用KANA作为模板分子。得益于DA的自聚性质，在Fe3O4@UiO-66表面形成了印迹层，无需外加引发剂或交联剂。聚合后，通过洗脱剂去除模板分子，然后成功制备了FUMIP。

**结论**
总之，成功开发了一种双识别夹心型荧光生物传感器，用于食品样品中KANA的快速超灵敏检测。通过将MIP集成到Fe3O4@UiO-66支撑材料上，并与Apt-FAM探针结合，该生物传感器实现了高特异性靶标识别、高效富集和放大的信号输出。这种双识别生物传感器不仅灵敏且快速（<30分钟），还具有宽广的线性范围（0.01 - 1000 ng/mL）和极低的检测限。

**作者贡献声明**
Wang Tingting：撰写——原始草稿、验证、方法学、研究、概念化。Zhao Fengjuan：资源、研究。Suo Zhiguang：方法学、正式分析。Liu Yong：方法学、正式分析。Huang Yawei：撰写——审阅与编辑、资源、资金获取。Wei Min：撰写——审阅与编辑、监督、资源、资金获取、概念化。

**利益冲突声明**
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。

**致谢**
本研究得到了国家自然科学基金（编号32502346）和河南省重点科技项目（262102110144）的资助。

Tingting Wang | Fengjuan Zhao | Zhiguang Suo | Yong Liu | Yawei Huang | Min Wei
河南工业大学食品科学与技术学院，河南省谷物与油料食品安全与营养重点实验室，郑州，450001，中国