单独使用 eCG 或联合使用 GnRH 类似物布舍瑞林进行超数排卵，可提高断奶母猪的可移植胚胎产量，且不影响第 6 天胚胎的形态学、细胞学及转录组参数

《Animal Reproduction Science》：Superovulation with eCG alone or combined with the GnRH analogue buserelin improves transferable embryo production in weaned sows without affecting Day 6 embryo morphological, cellular, and transcriptomic parameters

　　

摘要
高效的超数排卵方案对于提高猪胚胎移植（ET）项目的效率并便于安排日程至关重要。尽管 hCG 广泛用于基于 eCG 的超数排卵后的排卵同步，但其可用性受限凸显了对无 hCG 策略的需求。GnRH 激动剂可以扩展基于 eCG 的超数排卵方案内的排卵诱导选项。在本研究中，经产断奶供体母猪分别接受单独 eCG（断奶后 24 小时，1000 IU）、eCG 加布舍瑞林（GnRH 激动剂，发情开始时 10 μg），或不接受激素处理（对照），并在发情后第 6 天回收胚胎，以评估排卵反应、胚胎生产效率、发育同步性和囊胚转录组谱。两种激素方案均独立地将排卵反应提高了约 48%（约 37 个 vs 25 个黄体；P < 0.001），并将可移植胚胎生产效率翻倍（与对照组相比；P < 0.001），而不影响妊娠率、受精率、胚胎活力、总细胞数或凋亡。未处理的母猪表现出最大的发育分散性和更高比例的孵化囊胚，而接受 eCG 处理的母猪表现出中等变异性。添加布舍瑞林进一步改善了排卵 - 胚胎同步性，大多数胚胎处于囊胚阶段，所有活力胚胎均被归类为可移植。转录组谱分析确定了处理和对照组胚胎之间有限数量的差异表达基因。总之，两种无 hCG 处理均增加了断奶母猪的胚胎产量，而未对评估的第 6 天囊胚质量参数产生不利影响，而添加布舍瑞林进一步改善了收集时的胚胎阶段同步性。总体而言，这两种方案代表了商业条件下体内猪胚胎生产的实用无 hCG 策略。

引言
猪胚胎移植（ET）是现代动物育种的关键工具，能够实现优良种质的安全分布，并支持遗传改良和基因编辑策略 (Brüssow et al., 2000, Martinez-Serrano and Martinez, 2025)。它还有助于动物福利和疾病控制，通过减少动物移动并促进珍贵遗传资源的保存 (Xingzhu et al., 2021)。此外，猪和人类之间的生理相似性突出了 ET 在转化研究中的相关性，包括人类疾病模型和前瞻性异种移植研究 (Chen et al., 2023, Xi et al., 2022)。过去几十年，包括精细的非手术深子宫 ET 和短期及长期胚胎保存的进展在内的显著进步，显著改善了猪 ET 的实际实施 (Gil et al., 2025, Martinez et al., 2019, Martinez et al., 2016)。然而，尽管有了这些发展，猪 ET 的有效应用仍依赖于需要进一步细化的技术因素。

目前，体内来源的胚胎（紧凑型桑椹胚和未孵化囊胚）仍然是 ET 的首选选项，因为与体外产生的胚胎相比，它们具有始终更优越的发育能力，从而确保应用繁殖技术中更可靠和可重复的结果 (Martinez-Serrano and Martinez, 2025)。因此，增加高质量体内胚胎生产的策略，特别是通过优化超数排卵方案，对于猪 ET 的实际应用至关重要，尤其是在以前激素可用性受限的情况下。

ET 项目的一个主要限制是每次移植所需的胚胎数量大（超过 25 个），导致供体与受体比例高于 2:1 (Martinez et al., 2016)。供体雌性动物的超数排卵是提高此比率的有效策略，但需要预先同步以便于分组和胚胎回收。在此背景下，断奶母猪代表合适的供体候选者，因为断奶可靠地在七天内诱导发情。与使用 altrenogest 同步的母猪不同 (Gonzalez-Ramiro et al., 2022, Gonzalez-Ramiro et al., 2021)，断奶母猪中基于促性腺激素（eCG, hCG）的超数排卵显著增加了排卵反应和存活、可移植胚胎的数量，而未增加未受精卵或退化胚胎，且未损害非手术 ET 后的生育力或产仔数 (Angel et al., 2014, Hazeleger et al., 2000)，从而将供体与受体比例降低到 1.5–1.1:1。在实践中，这些方案通常涉及在断奶后 24 小时给予 1000 IU eCG 以增加卵泡数量，因为这种方法比基于 FSH 的超刺激更实用，后者需要重复每日注射。随后通过在发情开始时给予 750 IU hCG 来同步排卵 (Angel et al., 2014, Gonzalez-Plaza et al., 2023, Martinez et al., 2020, Martinez et al., 2015)。兽医 hCG 在猪商业可用性方面的以前限制凸显了验证替代的无 hCG 策略的需要，以扩展实用选项并改善猪 ET 项目中的胚胎收集日程安排。eCG 治疗可以补充排卵诱导剂 pLH 或 GnRH。pLH 已显示出与 hCG 相当的功效，用于控制排卵时间 (Bennett-Steward et al., 2008, Cassar et al., 2005)。然而，其在母猪中诱导排卵的使用受限，因为其循环半衰期短，且重现内源性排卵前 LH 峰幅度和持续时间的能力有限，所有这些都导致排卵反应不一致。

1970 年代初对 GnRH 十肽的初步特征描述促进了其化学合成以及随后强效激动剂类似物的开发 (Mezo, 2014)。GnRH 激动剂在垂体水平起作用，刺激内源性 LH 的释放。因此，GnRH 在生物上比 hCG 更自然，hCG 直接作用于卵巢 LH 受体以诱导排卵 (Ziecic et al., 2021)。几种 GnRH 激动剂，包括布舍瑞林（BU），已被评估其引发性腺 LH 释放和触发母猪排卵的能力 (Falceto et al., 2023)。在卵泡晚期给药时，BU 有效提前排卵时间 (Baroncello et al., 2017) 并减少其反应变异性，允许改善排卵和人工授精（AI）之间的同步性 (Pearodwong et al., 2019)。在商业猪生产中，BU 常用于在 altrenogest 同步发情或断奶后诱导排卵，方便后备母猪和断奶母猪的定时人工授精（FTAI）方案 (Baroncello et al., 2017, Driancourt et al., 2013, Falceto et al., 2023, Lopes et al., 2020, Martinat-Botté et al., 2010, Pearodwong et al., 2019, Shi et al., 2025, Suárez-Usbeck et al., 2021)，尽管结果仍受卵泡状态、剂量和给药时间的影响 (Falceto et al., 2023)。尽管 BU 和其他 GnRH 激动剂在断奶母猪的排卵诱导和 FTAI 中已被广泛研究，但它们在 eCG 诱导超数排卵的胚胎供体母猪中的使用仍未被充分描述。这很重要，因为 eCG 通过其 FSH 样和 LH 样活性刺激卵泡发育并改变 GnRH 激动剂随后作用的卵巢内分泌环境 (De Rensis and Kirkwood, 2016)。因此，在非超数排卵母猪中使用 BU 获得的结果不能直接外推到 eCG 超数排卵的胚胎供体。此外，这些无 hCG 策略对可移植胚胎生产、收集时的胚胎阶段同步性、第 6 天囊胚质量标志物和囊胚转录组谱的影响尚未被完全评估。另一方面，在猪中，eCG 由于能够结合猪 FSH 和 LH 受体而表现出 FSH 样和 LH 样活性 (Farmer and Papkoff, 1979, Kirkwood and Kauffold, 2015)。这种双重促性腺激素特征支持卵泡募集和生长，同时也促进排卵前卵泡的最终成熟。因此，当在适当的剂量和卵泡发育阶段给药时，单独 eCG 可以诱导排卵并维持胚胎生产，而无需额外的排卵诱导剂 (Brüssow et al., 2009, Hühn et al., 1996)，尽管其延长的生物半衰期可能会降低排卵同步性并增加排卵时间的变异性。

我们假设单独 eCG 将比未处理对照组增加可移植胚胎生产，而在 eCG 诱导超数排卵后在发情开始时添加 BU 将改善收集时的胚胎阶段同步性，而不损害评估的第 6 天囊胚质量参数或引起主要转录组改变。因此，本研究旨在调查无 hCG 超数排卵策略对断奶供体母猪的影响，具体是单独 eCG 或联合 BU 对胚胎生产效率、收集时的胚胎阶段同步性和第 6 天囊胚质量参数的影响，包括形态、总细胞数（TCN）、凋亡率和囊胚转录组谱。

部分片段
材料与方法
除非另有说明，所有试剂均购自 Sigma-Aldrich Co. (Alcobendas, Madrid, Spain)。动物程序按照关于保护用于科学目的动物的指令 2010/63/EU 进行。实验方案经穆尔西亚大学动物实验伦理委员会批准（代码：850/2023）和西班牙穆尔西亚自治区畜牧、渔业和水产养殖部批准（代码：A13230503）。

繁殖参数
在断奶时纳入的 76 头母猪中，eCG 处理组（14/56）和对照组（5/20）均有 25.0% 的母猪在断奶后 3-5 天内未表现出发情。对于这个与发情相关的参数，由于 BU 是在发情开始当天给药的，eCG + BU 组的母猪被包含在 eCG 组中。在剩余的 57 头母猪中，eCG 处理组比对照组更频繁地在第 3 天观察到发情（P < 0.05）。相反，更多对照组母猪在第 5 天表现出发情（P < 0.05），

讨论
本研究评估了单独 eCG 和 eCG 联合 BU 作为体内猪胚胎生产在胚胎移植项目中的无 hCG 超数排卵策略。两种治疗均增加了排卵反应和可移植胚胎生产，而未对评估的第 6 天囊胚质量参数产生不利影响，而添加 BU 与收集时更均匀的胚胎阶段分布相关。这些发现扩展了以前基于 BU 的排卵工作。

结论
总之，用 1000 IU eCG 对断奶供体母猪进行超数排卵，无论是单独使用还是在发情开始时联合 BU，均有效地增加了场条件下胚胎产量，而未影响第 6 天妊娠、胚胎回收、受精率或标准胚胎质量参数。两种激素方案均将排卵反应提高了约 48%，并将可移植胚胎生产效率翻倍（与未处理母猪相比）。重要的是，添加 BU 改善了

伦理声明
本研究按照 ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南进行。本研究经西班牙穆尔西亚自治区畜牧、渔业和水产养殖部批准。（批准号。A13230503）

资助
本工作由西班牙科学、创新和大学部（MICIU）和国家研究局（AEI/10.13039/501100011033）支持，并由欧洲区域发展基金（ERDF/EU）共同资助，在 Project PID2022-137645OB-I00 和 PID2023-150622OA-100 下（马德里，西班牙）；穆尔西亚自治区 Séneca 基金会（FSRM/10.13039/100007801）在 Project 23014/GERM/25 下（穆尔西亚，西班牙）；以及林雪平大学（LiU-303668, 林雪平，瑞典）。

CRediT 作者贡献声明
Manuela Garcia-Canovas：写作 – 回顾与编辑，方法论。Henar Gonzalez-Ramiro：写作 – 回顾与编辑，方法论。Heriberto Rodriguez-Martinez：写作 – 回顾与编辑，监督，资源，项目管理，资金获取。Cristina A. Martinez-Serrano：写作 – 回顾与编辑，验证，监督，方法论。Adelina Lopez-Jara：写作 – 原始草稿，方法论。Inmaculada Parrilla：写作 – 回顾与编辑，监督，项目管理，

利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系，这可能会出现在影响本文报告工作的情况下。

致谢
作者感谢 Agropor SA 猪场（西班牙穆尔西亚）的工作人员在动物护理和群管理方面的宝贵协助。

Adelina Lopez-Jara|Manuela Garcia-Canovas|Henar Gonzalez-Ramiro|Carolina G. Cabrera-Gomez|David Gascon-Collado|Paula Blanco-Cueto|Maria A. Gil|Cristina Cuello|Inmaculada Parrilla|Emilio A. Martinez|Heriberto Rodriguez-Martinez|Cristina A. Martinez-Serrano
穆尔西亚大学国际卓越高等教育与研究校区"Campus Mare Nostrum"动物医学与外科系，西班牙穆尔西亚