新城疫病毒诱导的干扰素调控人肿瘤细胞与正常细胞中PD-L1和MICA的表达

《ImmunoTargets and Therapy》：Newcastle Disease Virus – Induced Interferons Regulate PD-L1 and MICA Expression in Human Tumor and Normal Cells

　　

目的：探究新城疫病毒（NDV）和/或NDV诱导的干扰素（IFN）是否调控程序性死亡-1配体（PD-L1）的表达，并调节抑制性与激活性免疫信号之间的平衡。材料与方法：研究采用人非恶性细胞系（NB1RGB和HEK293）及肿瘤细胞系（A549和U87MG）。细胞分别感染NDV LaSota毒株或用干扰素（IFN）处理。通过流式细胞术、蛋白质印迹法（Western blotting）和免疫荧光法分析PD-L1的表达。采用双显色原位杂交技术评估作为免疫抑制分子的PD-L1与作为免疫激活分子的主要组织相容性复合体Ⅰ类多肽相关序列A（MICA）之间的关系。为探究NDV诱导的PD-L1/MICA轴偏移是否足以激活外周血单个核细胞（PBMC）内表达自然杀伤细胞2族D（NKG2D）受体的细胞，在PBMC与预先感染NDV或经IFN-λ处理的肿瘤及正常细胞系共培养24小时后，检测其IFN-γ的产生。结果：NDV感染及IFN处理导致特定细胞类型中PD-L1表达降低。原位杂交显示，该降低伴随MICA表达的同步上调。PD-L1与MICA之间平衡的偏移与表达NKG2D受体的免疫细胞激活增强相关，其证据为IFN-γ分泌增加。结论：上述研究结果提示，NDV可能通过调节抑制性检查点分子与激活性配体之间的平衡发挥抗肿瘤作用，具体机制为下调PD-L1并上调MICA。该机制凸显了NDV增强细胞毒性免疫应答的潜力，并支持将其进一步开发为癌症免疫治疗的新策略。

抗癌免疫治疗的有效性取决于其启动肿瘤靶向免疫应答、改善免疫抑制性肿瘤微环境以及对免疫效应机制敏感性的能力。溶瘤病毒可选择性地在肿瘤细胞内复制、杀伤并扩散，是一种颇具前景的癌症治疗策略。新城疫病毒（NDV，一种禽类病原体）作为强效抗肿瘤剂已被研究数十年，其溶瘤机制既包括直接杀伤，也包括通过刺激促炎性介质以及由自然杀伤（NK）细胞和CD8⁺ T细胞介导的抗原非依赖性或依赖性裂解来间接发挥作用。NDV作为RNA病毒，感染后可通过上调干扰素调节因子（IRF）-1和IRF-3强烈诱导多种干扰素（IFN）。然而，既往研究显示NDV可上调荷瘤小鼠的PD-L1和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA-4），提示可能伴随免疫抑制性检查点分子的上调；同时，NDV诱导的IFN是否同步调控激活性配体MICA（主要组织相容性复合体Ⅰ类多肽相关序列A，一种在细胞应激或恶性转化时诱导表达、向免疫效应细胞传递"杀伤信号"的NKG2D配体）、以及PD-L1与MICA之间的平衡是否决定NKG2D受体介导的免疫激活，此前均无研究报道。为此，研究人员提出假说：NDV及其诱导的IFN以细胞类型特异性方式改变PD-L1/MICA平衡，且该平衡决定外周血单个核细胞（PBMC）中NKG2D受体表达细胞的激活。该研究论文发表于《ImmunoTargets and Therapy》。

研究人员采用的主要技术方法包括：以人非恶性细胞系NB1RGB（皮肤成纤维细胞）和HEK293（转化胚肾细胞）及肿瘤细胞系A549（非小细胞肺癌）和U87MG（多形性胶质母细胞瘤）为研究对象（PBMC来源于同一健康供者全血经Ficoll密度梯度离心分离）；使用低毒力NDV LaSota毒株（经鸡胚尿囊腔增殖、TCID₅₀滴定）以0.01或0.001感染复数（MOI）感染细胞，或以IFN-α、β、λ混合物及单独IFN-λ处理；通过流式细胞术和蛋白质印迹法（Western blot）检测PD-L1蛋白表达及与碘化丙啶（PI）共染评估细胞活力动力学；采用RNAscope双显色原位杂交（ISH）半定量分析PD-L1与MICA mRNA转录水平；免疫荧光法观察细胞表面PD-L1；将预处理细胞与PBMC共培养后通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测IFN-γ；并以Western blot分析IRF-1、IRF-3及磷酸化IRF-3（p-IRF-3）。

研究结果方面，在"MOI依赖性NDV感染调控PD-L1表达"部分，流式细胞术与Western blot显示，模拟感染的肿瘤细胞（A549、U87MG）PD-L1基础表达高于正常细胞；NDV感染以MOI依赖方式降低肿瘤细胞PD-L1，反而升高正常细胞NB1RGB和HEK293的PD-L1，呈现细胞类型特异性免疫调控。在"延长NDV感染导致不同的PD-L1与PI表达动力学"部分，72小时动力学实验显示NDV感染组PD-L1总体呈下降趋势，U87MG和NB1RGB在48及72小时显著降低；PI染色显示感染后细胞毒性先升高，72小时时与对照无差异，与LaSota毒株在这些细胞中弱复制一致。在"NDV感染与IFN调控PD-L1和MICA mRNA表达"部分，双显色ISH半定量分析表明，NDV感染24小时普遍降低PD-L1转录评分，肿瘤细胞降幅大于正常细胞；各细胞MICA基础表达低，NDV感染后上调；IFN-α/β/λ联合处理显著降低肿瘤细胞PD-L1并上调MICA，提示肿瘤细胞对IFN更敏感，PD-L1与MICA间存在负反馈调控。在"NDV与IFN-λ暴露后PD-L1表面蛋白免疫荧光检测"部分，单独IFN-λ（3000 IU）处理即足以调控PD-L1表面表达，肿瘤A549和U87MG细胞中降低最为明显，而正常细胞略有升高，且程度因细胞类型而异。在"NDV与IFN-λ对NKG2D受体表达细胞的激活依赖于PD-L1与MICA平衡"部分，PBMC共培养实验显示，IFN-λ预处理以时间依赖方式提高IFN-γ分泌，U87MG在48小时显著升高；NDV预感染则抑制正常细胞的IFN-γ产生（NB1RGB在24、48、72小时及HEK293在72小时显著），但在肿瘤细胞中不同时间点（A549于48小时、U87MG于24小时）促进IFN-γ产生，与ISH观察到的PD-L1/MICA诱导幅度差异相符。在"NDV感染或IFN刺激后IRF-1与IRF-3的调控"部分，Western blot显示肿瘤细胞IRF-1基础表达高于正常细胞，NDV感染后各细胞IRF-1均升高，HEK293和U87MG中IRF-3磷酸化增强；IFN-α、β、λ在不同程度上可诱导IRF-1和IRF-3，但尚不能断定NDV感染引起的上调依赖于其诱导的IFN。

讨论部分，研究人员指出，尽管溶瘤NDV疗法已显示降低肿瘤负荷和激发抗肿瘤免疫的潜力，但部分研究中PD-L1伴随上调需谨慎对待。本研究证明NDV感染及IFN处理以时间和剂量依赖方式降低高基础PD-L1表达的肿瘤细胞中PD-L1蛋白，同时伴随细胞死亡增加，提示NDV诱导的IFN兼具PD-L1调控与细胞毒性效应。PD-L1下调与MICA mRNA上调同步发生，提示两种相反免疫信号在转录水平受到协同调控，该反向关系可能反映经PD-L1/MICA轴介导的免疫稳态机制。功能实验表明IFN-γ产生并不总与MICA上调同步，单独MICA上调在PD-L1高表达时不足以激活NKG2D受体细胞，提示功能结局由PD-L1与MICA的平衡而非单一分子决定，可能需要PD-L1/MICA平衡偏移至临界阈值以下才能有效激活NKG2D介导的细胞毒性。研究人员亦承认研究局限：部分细胞的Western blot与流式分析未完成、未采用原代或患者来源细胞及体内模型验证、仅使用低毒力LaSota毒株，未来应纳入中等毒力及强毒力毒株比较，并通过细胞毒性实验和PBMC亚群分析明确IFN-γ的细胞来源。

结论部分翻译如下：总之，本研究提供证据表明，NDV感染及NDV诱导的IFN以细胞类型特异性方式调节抑制性与激活性免疫配体之间的平衡，在肿瘤细胞系中降低PD-L1表达的同时上调MICA。这些发现提示，PD-L1/MICA轴的协同偏移（而非任一分子的独立变化）可能是NKG2D受体表达细胞激活及IFN-γ产生的关键决定因素。尽管上述结果令人鼓舞，但关于所涉调控通路的明确机制结论仍有待通过进一步实验验证，包括使用基因敲除细胞系、通路抑制剂及体内模型。未来研究还应独立阐明Ⅰ型与Ⅲ型IFN的具体贡献、IRF-1和IRF-3作为潜在调控介质的作用，以及PBMC亚群内IFN-γ的细胞来源。总体而言，这些发现是理解NDV溶瘤治疗在免疫检查点调控中免疫调节潜力的早期步骤，并可能为在PD-L1介导的免疫抑制为关键特征的肿瘤中与现有检查点抑制剂疗法联合的策略提供基础。