Mirror-Peptidizer：通过计算机模拟镜像筛选实现D-肽结合物的从头设计，无需合成D-蛋白

《Research》：Mirror-Peptidizer: In Silico Mirror-Image Screening Enables De Novo Design of D-Peptide Binders without D-Protein Synthesis

　　

摘要 D-肽因其通常比对应的L-肽更耐受蛋白水解而成为有吸引力的治疗模式，然而针对靶标的D-肽的系统性设计仍然具有相当的难度。在此，研究人员报道了Mirror-Peptidizer，这是一个端到端的计算机模拟镜像筛选工作流，可在无需化学合成D-蛋白靶标的情况下生成D-肽结合物。该工作流将L-蛋白结构镜像为虚拟的D-蛋白，利用基于扩散的骨架生成器在镜像靶标存在下设计L-肽骨架，通过神经序列设计模型选择序列，并借助平衡序列-骨架相容性与溶解度启发式指标的贝叶斯多目标优化（Bayesian Multi-objective Optimization）探索局部序列邻域。对所得复合物进行镜像操作，即可得到预测结合天然L-靶标的相应D-肽。以MDM2、PD-L1和白介素-23受体（interleukin-23 receptor，IL-23R）作为测试案例，研究人员鉴定了涵盖α-螺旋、β-富集和混合构象的D-肽，其亲和力从11.9 nM到亚微摩尔水平。对于MDM2体系，1H-15N HSQC（异核单量子相干谱，heteronuclear single quantum coherence）扰动和蛋白质点突变实验支持所设计的界面，并且细胞穿膜偶联物显示出p53依赖性的癌症生长抑制。类似地，靶向PD-L1的D-肽在体外竞争性结合实验中有效抑制了PD-1/PD-L1相互作用，而靶向IL-23R的D-肽在人类外周血单个核细胞中抑制了IL-2/IL-12/IL-23诱导的干扰素-γ产生。Mirror-Peptidizer以开源实现形式提供，以促进可实验验证的D-肽起始候选物的快速生成。

《Research》论文解读：Mirror-Peptidizer——基于计算机模拟镜像筛选的D-肽从头设计

一、研究背景与问题

D-肽由D-型氨基酸组成，是天然L-肽的对映异构体，因其对蛋白酶具有更高的耐受性而被广泛研究为配体和抑制剂，有望成为一类有前景的治疗药物。然而，D-肽的系统性设计一直是计算生物学中的重大挑战。传统的镜像噬菌体展示技术需要化学合成折叠正确的D-蛋白靶标并进行实验筛选，这一过程劳动强度大、成功率低，难以广泛应用。此外，尽管AlphaFold 3在蛋白质-配体相互作用预测方面取得了进展，但其对D-肽结构的预测存在严重不足，平均手性错误率高达51%，与随机猜测无异。因此，亟需一种无需D-蛋白合成、不依赖实验展示筛选的全计算工作流，直接从L-蛋白结构生成可用于实验验证的D-肽结合物。基于此，研究人员开发了Mirror-Peptidizer这一端到端的计算机模拟镜像筛选流程。

二、研究内容与总体结论

研究人员提出了Mirror-Peptidizer，一种集成了坐标镜像、基于扩散模型的结合物骨架生成、神经序列设计以及贝叶斯多目标优化的计算流程。该方法的基本策略并非直接生成D-肽结构，而是先将L-蛋白靶标计算镜像为虚拟D-蛋白，在镜像靶标存在下设计L-肽骨架和序列，随后将所得复合物进行坐标镜像，从而得到预测结合天然L-靶标的D-肽。研究人员将该方法应用于MDM2、PD-L1和IL-23R三个治疗相关靶点，成功设计了具有不同结构构象（α-螺旋、β-折叠和混合构象）的高亲和力D-肽，亲和力从11.9 nM到亚微摩尔不等。该研究发表于《Research》。

三、主要技术方法

Mirror-Peptidizer工作流包含以下几个关键模块。首先，将L-蛋白靶标的PDB坐标沿x轴进行确定性坐标反射，生成虚拟D-蛋白受体。其次，使用基于E(3)-等变图神经网络（GNN）的条件生成扩散模型Chroma，在固定D-型受体坐标下生成L-肽骨架。随后，使用深度学习框架ProteinMPNN进行序列设计，在镜像L-坐标系统中基于残基水平条件概率优化肽链氨基酸序列。最后，采用基于期望函数的多目标贝叶斯优化（BO）过程，以模糊得分（FuzzyScore）为排序依据，平衡序列-骨架相容性（ProteinMPNN得分）与溶解度加权指数（SWI），排除理化性质不佳的候选物。全流程已开源。

四、研究结果

（一）Mirror-Peptidizer用于设计镜像肽结合物

研究结果表明，该工作流首先通过坐标变换将天然L-构型靶蛋白手性反转，生成镜像靶蛋白；随后由Chroma生成与D-型靶标结合的L-肽骨架，再经ProteinMPNN进行序列优化，最后通过贝叶斯优化迭代改进序列并筛选候选物。与传统镜像噬菌体展示相比，该方法完全消除了D-蛋白合成需求，代表了D-肽开发的重要进步。

（二）通过Mirror-Peptidizer设计MDM2结合D-肽

以MDM2（PDB：2GV2）为靶标，研究人员生成了一系列MDM2结合D-肽（MBDPs）。算法在不同长度的肽上表现出一致的MPNN得分，其中长度为10的肽在MDM2结合方面显示出最优密度。结构分析揭示了MBDP-1、MBDP-2和MBDP-3与MDM2结合口袋的多样而互补的相互作用。核磁共振（NMR）实验证实了MBDP-1定位于MDM2的p53结合位点，Y100、F55、K51和M62等残基在HSQC谱中表现出显著扰动，与计算预测高度一致。

（三）MBDPs的结合与功能表征

等温滴定量热法（ITC）实验表明，9个候选肽中有4个对MDM2具有高亲和力，其中最强的MBDP-1的K_D值达到11.9 nM。定点突变实验证实了NMR揭示的结合界面。圆二色（CD）光谱分析显示MBDP-1至MBDP-4具有α-螺旋结构。将细胞穿膜序列R6偶联至MBDPs后，DR6-MBDP-1和DR6-MBDP-2能有效抑制HCT116 p53^+/+细胞的增殖并诱导凋亡，但在p53^?/?细胞中无此效果，且对照偶联物活性很低。Western blot分析证实DR6-MBDP-1诱导p53积累和p21上调，表明其通过MDM2/p53通路发挥作用。

（四）通过Mirror-Peptidizer设计PD-L1结合D-肽

以PD-L1（PDB：6PV9）为靶标，研究人员设计了PD-L1结合D-肽（PBDPs）。长度为9个氨基酸的肽在MPNN得分上具有优势。结构分析显示PBDP-1以β-折叠构象通过广泛的氢键网络与PD-L1结合。ITC实验表明PBDP-1的K_D为64.9 nM，PBDP-2为313 nM。K75A突变使亲和力从64.9 nM下降至1.03 μM，验证了预测界面。CD光谱确认了β-折叠构象。在细胞模型中，PBDP-1和PBDP-2有效阻断PD-1/PD-L1相互作用，疗效与阳性对照纳武单抗（nivolumab）相当。

（五）通过Mirror-Peptidizer设计IL-23R结合D-肽

以IL-23R（PDB：5MZV）为靶标，研究人员设计了IL-23R结合D-肽（IBDPs）。IBDP-1呈现部分α-螺旋与柔性区的混合构象，通过关键氢键和疏水相互作用与受体结合。ITC测定其K_D为679 nM，生物层干涉法（BLI）测得K_D为490 nM。IL-23R三突变体（N27A/N29A/Y100A）使结合显著减弱或无法检测。在人外周血单个核细胞（PBMCs）中，IBDP-1以浓度依赖性方式抑制IL-2/IL-12/IL-23诱导的IFN-γ产生，IC₅₀为1.70 μM。

（六）镜像衍生设计的基准测试与立体化学质控

研究人员对三个靶标进行了全面的基准测试。Chroma为每个靶标生成了结构多样的肽骨架库，经质量控制后分别保留了225（MDM2）、194（PD-L1）和158（IL-23R）个骨架。ProteinMPNN每个靶标生成约4000个候选序列，再经结构相容性和序列复杂性过滤。D/L配对设计分析显示，镜像衍生D-肽候选物与直接L-肽设计在序列空间和结合模式上存在显著差异。手性质量控制分析验证了确定性镜像变换正确反转骨架手性并保持二面角一致性。模块消融实验表明，完整的Chroma + ProteinMPNN + BO流程在序列-骨架相容性和合成可处理性之间提供了更平衡的结果。对TNF-α、CXCR2和CXCR4三个额外靶标的测试进一步表明该流程具可推广性。

五、讨论与结论

该研究表明，D-肽的结构可变性源于靶蛋白拓扑结构的不同：MDM2具有深疏水沟槽，天然偏好α-螺旋配体；PD-L1表面平坦开放，算法生成了通过广泛氢键网络结合靶面的β-折叠肽；IL-23R结合裂隙浅而不规则，需要更大的构象灵活性。该工作流的局限性在于其排序函数并未显式计算最终D-肽与天然L-蛋白靶标之间的分子间结合能，因此最高排序候选物应被视为优先实验验证的序列而非全局最优结合解。总之，Mirror-Peptidizer代表了一种高效的D-肽从头设计流程，能够在无需合成D-蛋白的情况下生成具有不同结构基序、可实验验证的D-肽结合物，为D-肽药物开发提供了一种实用且可推广的策略。