整合性的甲基组与转录组分析揭示了dmrt1纯合雄性中国舌鳎（Cynoglossus semilaevis）个体间生长差异的分子基础

《Aquaculture》：Integrated methylome and transcriptome analysis reveals molecular bases for growth variation in dmrt1-homozygous male Chinese tongue sole ( Cynoglossus semilaevis)

　　

摘要

中国舌鳎（Cynoglossus semilaevis）是中国的一种商业化海水养殖物种。然而，由于性别生长差异明显（雌性体型是雄性的2-4倍），以及养殖环境中生长缓慢的雄性占多数（70-90%），导致整体生产力低下和养殖周期延长，这成为该行业的主要瓶颈。有趣的是，在中国舌鳎中，雄性dmrt1基因的纯合敲除会使其表现出类似雌性的快速生长特征。为了阐明这一现象的表观遗传基础，我们对野生型雄性鱼肝脏、肌肉（ML, MM），野生型雌性鱼肝脏、肌肉（FL, FM）以及dmrt1^?/?雄性鱼肝脏、肌肉（DL, DM）进行了全基因组亚硫酸盐测序（WGBS）和转录组测序。

通过整合甲基化组和转录组分析，发现了多个差异甲基化基因（DMGs），这些基因在肝脏和肌肉组织中的启动子甲基化水平与基因表达呈负相关。这些候选基因主要与细胞骨架组织、肌肉发育、细胞周期调控、表观遗传调控、钙平衡和线粒体动态有关，表明这些途径可能与dmrt1^?/?雄性的生长变化有关。代表性基因包括clec4a、atp2a1、g6pc和slc23a1。这些发现为了解中国舌鳎中dmrt1相关的生长调控的表观遗传机制提供了新的见解，并为提高养殖中雄性的生长性能提供了潜在的分子靶标。

引言

中国舌鳎（Cynoglossus semilaevis）是一种具有重要商业价值的海洋扁平鱼类，分布于东亚沿海地区，在中国、朝鲜和日本等国家进行养殖。它在中国海洋经济和水产养殖行业中发挥着重要作用（Chen和Xu，2018）。作为一种高价值的养殖鱼类，中国舌鳎的年养殖产值约为15亿元人民币，其性别生长差异明显（Zhou和Chen，2016）。由于其极端的雄雌生长差异，它已成为研究表观遗传调控的宝贵模型。尽管在约5个月大时雄性和雌性的体重相当，但雄性在9个月左右会提前性成熟，此后其生长显著受到抑制。到21个月大时，雌性的平均体重达到621.4±86.4克，约为雄性的3.28倍（Ji等人，2011），成年雌性在体重和体长方面通常都是雄性的2-4倍（Ji等人，2011）。由于当前中国舌鳎的的商品市场体重大约为0.6-1.5公斤，体型较大的鱼价格更高（Wang等人，2025），雄性的生长性能有限极大地降低了养殖效率和经济收益。在养殖群体中，雄性通常占70-90%，但它们较小的体型和较慢的生长速度进一步降低了生产效率和经济收益。因此，阐明性别生长差异的分子机制并开发性别控制或生长促进策略对于改善中国舌鳎的养殖具有重要意义。

Dmrt1是调控脊椎动物性腺发育的高度保守的因子，在睾丸的发育和功能中起着重要作用（Augstenová和Ma，2025）。在中国舌鳎中，通过TALEN技术破坏dmrt1基因会导致雄性突变体不育（Cui等人，2017）。同时，dmrt1^?/?雄性表现出显著的体型变化，其生长模式与野生型雌性非常相似，成年后体型更大（Zhou等人，2024）。现有证据表明，破坏dmrt1的功能会调节多种鱼类的体型和体细胞生长。例如，在黄鲈鱼中，siRNA介导的dmrt1表达下调使雄性个体体型比对照组更大（Xie等人，2025）。而在斑马鱼中，dmrt1^?/?雄性的繁殖能力受损但体细胞生长增强；相反，转基因过表达该基因则导致雄性体长和体重显著降低（Ge等人，2025）。尽管在中国舌鳎的dmrt1^?/?雄性中也观察到了类似的促生长表型，但其背后的分子机制尚不清楚。这一表型值得进一步研究，以探讨生长相关基因的转录调控机制以及启动子相关DNA甲基化在此发育变化中的作用。

DNA甲基化是一种重要的表观遗传调控机制，它影响基因表达和细胞过程。该过程涉及在CpG二核苷酸中的胞嘧啶碱基上共价添加甲基（Zhang等人，2025）。虽然基因体和内含子区域的DNA甲基化也会影响鱼类中的基因表达和环境响应性表型，但启动子甲基化是最被广泛研究的机制。因此，本研究主要关注启动子相关DNA甲基化。启动子甲基化和低甲基化对转录活性有关键调控作用：高甲基化会阻碍转录因子与识别位点的结合，同时招募甲基-CpG结合域蛋白（MBPs；例如MeCP2）在甲基化CpG岛处形成抑制复合体，从而抑制基因表达（Liu等人，2022；Rimoldi等人，2024）。相反，低甲基化的启动子通过减轻表观遗传沉默来重新激活转录，直接影响发育过程。在鱼类中，DNA甲基化在胚胎发育、性别决定和生长调控中起重要作用（Beato等人，2026；Matlosz等人，2024；Rajendiran等人，2021）。最近的研究表明，DNA甲基化和去甲基化通过表观遗传方式调节肌肉前体细胞的增殖、分化和融合以及肌母细胞的增殖和肥大（Xie等人，2023）。尽管鱼类生长和发育过程中的转录调控由多种表观遗传机制协调，包括DNA甲基化、非编码RNA和组蛋白修饰，但启动子相关DNA甲基化仍然是调节转录和生长相关基因表达的最被广泛研究的机制之一。因此，本研究特别关注启动子DNA甲基化，以探讨其与dmrt1^?/?雄性中国舌鳎增强生长表型的潜在关联。

基于研究重点，本研究探讨了DNA甲基化在中国舌鳎dmrt1^?/?雄性生长机制中的调控作用。实验鱼的表型特征和dmrt1敲除基因型与我们之前的研究结果一致（Zhou等人，2024），因此在此不再赘述。我们对dmrt1^?/?雄性、正常雌性和正常雄性的肝脏和肌肉组织进行了全基因组DNA甲基化测序（WGBS）和转录组测序，系统分析了染色体和基因组区域中的DNA甲基化分布模式和变异特征。随后，筛选并确定了dmrt1^?/?雄性/正常雌性与正常雄性之间差异甲基化的区域（DMRs）。通过将这些DMRs与转录组分析得到的差异表达基因（DEGs）结合起来，确定了可能与dmrt1^?/?雄性加速生长表型相关的候选关键基因。这项研究为减少养殖中的性别差异提供了重要的表观遗传见解，通过揭示dmrt1^?/?鱼类的甲基化驱动的生长机制，支持了提高生长性能的遗传策略。

章节片段

样本采集

实验鱼（Cynoglossus semilaevis）来自唐山市威海漁业有限公司的苗种养殖场（中国河北）。本研究获得了黄海渔业研究院实验动物护理、伦理和安全检查表的批准（CAFSEMS，编号YSFRI-2025017）。选取了受精后9个月的雌性、雄性和dmrt1^?/?雄性中国舌鳎（每组n=6条）。在这一发育阶段，性别生长差异已经很明显。

雌性、雄性和dmrt1^?/?雄性鱼类两种组织中WGBS的概述

为了阐明dmrt1^?/?雄性Cynoglossus semilaevis生长加速的表观遗传机制，我们对9个月大的野生型雌性、野生型雄性和dmrt1^?/?雄性的肝脏和肌肉组织进行了全基因组亚硫酸盐测序（WGBS），获得了单碱基分辨率的基因组甲基化谱（图1A）。我们使用每个样本中CG碱基位置的甲基化率信息对所有样本进行了PCA分析（图1B）。

中国舌鳎中dmrt1^?/?雄性、野生型雌性和野生型雄性的DNA甲基化模式分析

Dmrt1编码一个含有Doublesex/Mab-3结构域（DM结构域）的保守转录因子，可以直接结合特定序列。越来越多的证据表明，dmrt1在调控与性腺发育相关的基因表达中起关键作用。此外，在多个dmrt1缺陷的雄性鱼类模型中观察到了生长加速和体型显著增大的表型。然而，其背后的分子机制尚不清楚

CRediT作者贡献声明

Xu Yan：撰写 – 原初草稿，验证，软件，方法论，实验研究。Chaoyang Su：软件，资源，方法论，实验研究。Fangzhou Cheng：软件，方法论，实验研究。Lanqing Ding：资源，实验研究。Fei Fang：资源，实验研究。Zhongkai Cui：撰写 – 修改与编辑，撰写 – 原初草稿，监督，概念构思。Songlin Chen：资源，项目管理，概念构思。

资金来源

本研究得到了国家自然科学基金（编号32230107和32102779）、国家重点研发计划（编号2022YFD2400101）、山东省重点研发计划（编号2023ZLYS02和2022ZLGX01）、中央公共利益科学机构基础研究基金，CAFS（编号2023TD20和2022CG01）以及山东省泰山学者攀登计划的支持。

Patel等人，2011

Tian等人，2025

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所报告工作的利益冲突或个人关系。

致谢

我们感谢所有匿名审稿人对本文的评论。

Xu Yan|Chaoyang Su|Fangzhou Cheng|Lanqing Ding|Fei Fang|Zhongkai Cui|Songlin Chen

青岛大学生命科学学院，青岛266071，中国