斑马鱼对吡啶酸毒性的多生物标志物响应及miR-153的变化：基于图像分析技术（IBR）的评价及计算机模拟机制分析

《Aquatic Toxicology》：Concentration-Dependent Multi-Biomarker and miR-153 Responses to Pyridaben Toxicity in Zebrafish: An IBR-Based Evaluation with In Silico Mechanistic Insights

　　摘要
本研究通过整合生化、分子和计算机模拟方法，探究了吡啶胺（PDB）在浓度为0.206-0.824 μg/L时对斑马鱼（Danio rerio）的48小时毒性。结果显示，斑马鱼的抗氧化系统具有同步性，SOD-GST和CAT-GPX活性在肝脏和鳃中表现出强烈的正相关。分子对接模拟证实PDB通过阻断CAT活性位点发挥竞争性抑制作用，而其与GST酶的相互作用支持了靶向生物转化反应。一个关键发现是分子和生化水平之间的功能解耦，表现为氧化应激阈值策略。尽管sod2和gclc转录本几乎被完全抑制，但在高浓度下SOD活性仍有所增加，这表明当转录支持耗尽后，斑马鱼依赖于预先存在的酶池。脂质过氧化的组织特异性动态显而易见：肝脏中的TBARS水平下降，而鳃中的TBARS水平则依赖于GST，与可用的解毒能力呈负相关。基因表达分析显示，nrf2转录本在0.670 μg/L时诱导显著增加，miR-153和hsp70在中间和较低浓度下分别表现出非线性峰值。在肌肉组织中，PDB在0.515 μg/L时诱导Ca2+-ATP酶活性并显著抑制乙酰胆碱酯酶（AChE）。免疫印迹反应（IBR）分析证实，环境相关浓度的PDB会严重损害生物体的稳态能力，表明其对无脊椎动物和脊椎动物非目标物种具有长期毒性，这与我们在大型溞（Daphnia magna）中的先前发现一致。总的来说，这些多层次的反应表明，即使低于致死剂量的PDB暴露也会导致浓度依赖性的氧化和蛋白质毒性损伤，具有重要的生态学意义。

引言
吡啶胺（PDB；IUPAC名称：2-tert-butyl-5-[(4-tert-butylphenyl)methyl-sulfanyl]-4-chloropyridazin-3-one；CAS号：96489-71-3）是一种非系统性的吡嗪酮类杀螨剂和杀虫剂，可作为线粒体复合物I抑制剂（Rand和Clark，2000）。它被用于农田、温室和果园中，以保护农作物免受各种螨虫和昆虫的危害（Ma等人，2021；土耳其农业和林业部，2023）。PDB残留物经常在各种淡水生态系统中被检测到，包括河流、湖泊和农业排水沟。地表水中的环境浓度存在显著的区域差异。例如，直接田间监测研究表明，黎巴嫩的Abou Ali河中PDB浓度高达0.390 μg/L（Jabali等人，2019），而在希腊北部的Doirani和Volvi淡水湖中，其最高浓度分别为13.2 ng/L和4.80 ng/L（Kalogridi等人，2014）。在农业活动密集的地区，如中国的蔬菜田，地表水中的PDB浓度可高达104 μg/L（Yang等人，2010）。此外，由于其高有机碳/水分配系数（logKoc=4.8）和亲脂性（logPow=6.4）（Fenoll等人，2010），PDB有很强的从水柱分配到环境沉积物中的趋势。其高logKoc值可导致大量沉积物积累，例如2.19 g/kg（Yang等人，2010），从而造成这种农药在水中的长期积累。土耳其Meri?河流域的环境监测进一步支持了这一趋势，其中PDB在水生沉积物中的积累量高达1.727 μg/kg（Tokatl?等人，2019）。此外，大气沉降也被报道为南极洲等非农业地区PDB积累的重要因素（Erdem，2018）。因此，这些暴露途径促进了PDB在非目标水生生物组织中的生物累积。2009年9月在中国江苏省南通市进行的一项野外生物监测研究中，PDB在蛇头鱼的内脏器官中积累量为0.710 μg/kg，在鲫鱼（Carassius auratus）的肌肉和内脏器官中分别为0.340 μg/kg和0.860 μg/kg（Wang等人，2012）。同样，在南极洲，PDB在本地鱼类Notothenia coriiceps的肌肉组织中积累量为0.46 μg/kg（Erdem，2018）。因此，PDB在淡水基质和非目标生物体内的持续存在和生物累积构成了持久的环境危害。

先前的研究表明，PDB会对斑马鱼（Danio rerio）造成严重的发育、生理和形态毒性，影响多种器官系统并破坏关键细胞通路。具体而言，PDB在心脏发育的关键循环阶段通过下调Wnt信号通路导致严重的心脏毒性，从而减弱其对氧化应激的保护作用，导致过度氧化应激引发的心肌细胞凋亡，最终表现为心包水肿、心脏肥大和功能性心力衰竭（Ma等人，2021）。在肝脏系统中，PDB破坏细胞内Ca2+平衡并抑制PI3K/Akt信号通路，导致肝细胞周期停滞和凋亡，体内表现为肝脏体积显著减小和卵黄囊吸收延迟（An等人，2024）。此外，PDB暴露通过抑制信号转导子和转录激活因子3（STAT3）信号通路，显著延缓早期胚胎发育，干扰细胞周期的正常进行，导致胚胎盾形成延迟、卵黄囊吸收延迟、体长缩短和孵化率降低（Qiang等人，2024）。除了这些发育障碍外，PDB还会在早期胚胎中引发严重的氧化应激，触发抗氧化系统的补偿性防御反应，表现为过氧化氢酶（CAT）活性和谷胱甘肽（GSH）含量显著增加，以防止进一步的氧化损伤（Qiang等人，2024）。除了斑马鱼外，PDB的强氧化性和肝毒性效应也在其他硬骨鱼类（如草鱼Ctenopharyngodon idella）中得到证实。在草鱼中，PDB暴露导致严重的氧化负荷，表现为活性氧（ROS）和脂质过氧化水平升高，同时GSH显著减少，超氧化物歧化酶（SOD）和CAT活性被抑制，最终导致线粒体功能障碍、炎症损伤和肝脏凋亡（Wu等人，2026）。这些发现共同表明，PDB在鱼类中的毒性主要由氧化应激引起，与线粒体功能障碍和关键发育信号通路的破坏有关，突显了该农药对非目标水生生物的慢性危害。

我们的最新研究采用了综合生物标志物响应（IBR）方法，揭示了PDB对淡水模式生物大型溞的负面影响。具体来说，亚急性和体外暴露于PDB会导致显著的渗透和氧化失衡，表现为抗氧化防御系统的破坏和Ca2+-ATP酶活性的抑制，最终导致形态畸形（Sevgiler和Atli，2025）。在此基础上，后续的多生物标志物研究证明，亚急性PDB暴露在生化和分子水平上引发了深刻的应激反应，表现为miR-153的显著上调以及与氧化应激相关的基因（如nrf2、sod、gclc和hsp70）的抑制（Atli等人，2026）。这些先前研究中选择的PDB浓度也反映了可能在水生生态系统中遇到的环境相关水平。本研究的主要目的是确定PDB在斑马鱼肝脏中的浓度依赖性氧化效应，同时在生化层面阐明鳃中的组织特异性差异。此外，我们还通过评估Ca2+-ATP酶和乙酰胆碱酯酶（AChE）活性，探讨了PDB对渗透调节和肌肉组织潜在神经毒性的影响。作为机制框架的一部分，纳入了计算机模拟分子对接分析，以评估潜在的PDB靶酶相互作用并提供分子层面的机制见解。利用IBR分析，另一个关键目标是确定PDB的环境毒性潜力在脊椎动物非目标物种中是否与其在无脊椎动物模型D. magna中的效应有所不同。

实验对象和条件
来自土耳其安卡拉Hacettepe大学实验动物应用与研究中心的幼年斑马鱼（D. rerio）。使用充气运输罐将鱼转移到土耳其阿达纳?ukurova大学渔业学院的Dr. Nazmi Tekelio?lu淡水研究设施。到达后，鱼被转移到含有去氯自来水的鱼缸中并恢复。转移过程中及之后没有发生死亡事件。所有个体均属于同一群体。

肝脏的多层次应激反应
PDB毒性对肝脏的响应在抗氧化生物标志物上表现出非线性模式。SOD活性在0.206 μg/L时最初下降，但随着暴露浓度的升高而增加，在0.824 μg/L时显著升高（表1）。相比之下，CAT活性在所有暴露组中均显著受到抑制，在0.515 μg/L时降幅最大。GPX活性在中间浓度下受到最明显的抑制。

讨论
本研究提供了全面证据，证明环境相关浓度的PDB亚急性暴露会在斑马鱼中引发高度复杂、组织特异性的氧化应激级联反应。最终，我们的发现表明，这种长期的氧化负荷会导致显著的转录抑制，同时驱动生化防御网络内的高度动态、浓度依赖性的补偿波动。

作者贡献声明
Gülüzar Atli：概念化、研究设计、数据可视化、方法验证、数据管理、项目监督、撰写初稿。Yusuf Sevgiler：概念化、方法设计、监督、软件开发、验证、研究、数据管理、可视化、写作与编辑。Serdar Kilercioglu：研究、方法设计、可视化。?a?da? ?imenler：研究、方法设计。