新分离自垃圾渗滤液处理活性污泥的氧化亚氮还原细菌Stutzerimonas frequens菌株E49的基因组与生理学特征

《Applied and Environmental Microbiology》：Genomic and physiological characterization of newly isolated nitrous oxide-reducing bacterium Stutzerimonas frequens strain E49 from landfill leachate-treating activated sludge

　　

摘要：氧化亚氮（N₂O）是一种强效温室气体和臭氧消耗物质，其百年时间尺度上的全球增温潜势约为CO₂的273倍。微生物将N₂O还原为二氮（N₂）是多种环境条件下减缓排放的关键途径。本研究首次报道了对新分离自处理垃圾渗滤液活性污泥的N₂O还原细菌——Stutzerimonas frequens菌株E49的全面基因组与生理学特征。全基因组测序揭示了一个4.51 Mbp的环状染色体和一个35.3 kbp的质粒，且基因组完整性高。功能注释鉴定出完整的反硝化基因集，包括nosZ，以及参与渗透压适应、与四氢嘧啶（ectoine）生物合成相关的ectABCD-ask基因簇。菌株E49为均匀杆状细菌（1.5–2.5 μm），在未外部添加有机碳源的厌氧条件下能高效还原N₂O，其生物量比速率为0.70 ± 0.02 μmol-N₂O/mg-生物量/h，细胞比速率为7.93 ± 0.23 × 10^?10 μmol-N₂O/细胞/h。在所测试的培养方案中，添加NH₄Cl且不含硝酸盐的DSMZ 1180培养基产生最高活性，表明N₂O呼吸受培养基类型依赖的调节。比较分析显示，在碳限制条件下，菌株E49的性能优于多种已报道的N₂O还原分离菌株。这些发现证明了菌株E49的代谢多功能性，并凸显其在低营养环境中作为N₂O生物汇的潜在作用。

论文解读文章

**一、研究背景与科学问题**

氧化亚氮（N₂O）是一种强效温室气体，其百年时间尺度上的全球增温潜势约为二氧化碳（CO₂）的273倍，同时参与平流层臭氧消耗。人为源N₂O排放主要来自农业活动和废水处理过程，其中微生物氮转化是关键环节。在废水处理厂（WWTPs）等工程化微生物系统中，不完全反硝化常导致N₂O作为中间产物积累。特定微生物含有nosZ基因，其编码的氧化亚氮还原酶（NosZ）可催化反硝化最后一步，将N₂O转化为惰性N₂。因此，鉴定和理解这类N₂O还原细菌（N₂ORB）对于开发减缓N₂O排放的微生物策略至关重要。

垃圾渗滤液处理系统是N₂O排放的高风险点位，渗滤液通常含高浓度氮化合物和盐分，高盐度（部分接近海水盐度的一半）带来渗透胁迫，可能影响反硝化效率和N₂O排放动态。属Stutzerimonas（近期从假单胞菌系统发育组重新分类而来）包含多种具有完全反硝化途径的代谢多样性细菌，部分物种表现出优异的N₂O还原性能。然而，关于该类群在基因组内容、N₂O还原生理学以及对高盐或寡营养条件耐受性的信息仍然有限。因此，研究人员从高盐垃圾渗滤液活性污泥中分离并表征具有N₂O还原能力的Stutzerimonas菌株，以填补这一知识空白。

**二、研究内容与主要结论**

研究人员采用膜生物膜反应器（MBfR）对处理垃圾渗滤液的活性污泥进行富集培养（运行604天，N₂O为唯一电子受体），通过连续三次有限稀释法分离获得纯菌株，命名为Stutzerimonas frequens strain E49。研究对该菌株进行了全基因组测序、系统发育分析、功能基因注释、形态学观察、N₂O还原活性测定以及微呼吸实验，系统揭示了其基因组特征和生理特性。

主要结论包括：①菌株E49基因组由4,514,130 bp环状染色体和35,333 bp环状质粒组成，GC含量63.6%，含4,208个编码序列（CDS），编码密度89.8%，完整性100%；②系统发育分析显示该菌株与S. frequens的平均核苷酸一致性（ANI）为97.11%，超过95%的物种界定阈值；③基因组含有完整反硝化基因集（narGHI、nirS、norBC、nosZ）及完整的ectABCD-ask四氢嘧啶生物合成基因簇，但缺乏甲烷/甲醇氧化相关基因；④菌株E49在未外部添加有机碳的厌氧条件下，可高效还原N₂O，生物量比速率为0.70 ± 0.02 μmol-N₂O/mg-生物量/h，细胞比速率为7.93 ± 0.23 × 10^?10 μmol-N₂O/细胞/h；⑤N₂O还原活性受培养基组成和预培养条件显著影响，在不含硝酸盐、添加NH₄Cl的改良DSMZ 1180培养基中活性最高；⑥乙酸盐添加未能刺激N₂O还原，提示内源储存物质或未知途径可能提供还原力。

该研究的重要性在于首次提供了S. frequens菌株的全面基因组与生理学特征，揭示了其兼性呼吸和渗透胁迫适应能力的组合优势，为理解N₂O还原细菌在营养受限环境中的功能提供了新见解，并可能支持废水处理等工程化系统中N₂O减排策略的开发。

**三、主要技术方法**

研究人员使用以下关键技术方法：①膜生物膜反应器（MBfR）富集培养技术，通过透气硅胶膜供给N₂O（5% vol/vol）作为电子受体，持续运行604天以富集N₂O还原菌；②有限稀释法结合16S rRNA基因Sanger测序和PCR-RFLP确认纯培养；③全基因组测序采用Oxford Nanopore长读段和MGI短读段混合组装策略，结合Pilon抛光获得无缺口完整基因组；④系统发育分析使用GTDB-Tk（120个标记基因）和FastANI计算平均核苷酸一致性；⑤功能注释使用DFAST和BlastKOALA映射至KEGG代谢通路；⑥N₂O消耗实验采用气相色谱-质谱联用（GC/MS）测定顶空N₂O浓度，结合干重和荧光显微镜计数计算比活性；⑦微呼吸实验使用Clark型安培微传感器连续监测溶解O₂和N₂O浓度。样本来源为日本东京某渗滤液处理厂的活性污泥。

**四、研究结果**

**（一）分离与基因组分析**

通过三次连续有限稀释从活性污泥中成功分离出单一菌株。基因组组装产生一个环状染色体（4,514,130 bp）和一个环状质粒（35,333 bp），GC含量63.6%，4,208个CDS，编码密度89.8%，12个rRNA基因，65个tRNA基因，无缺口，完整性100%。基于ANI的系统发育分析将菌株归类为Stutzerimonas属（隶属于Gammaproteobacteria），与S. frequens（RefSeq: GCF_024448335）的ANI为97.11%，超过95%的物种阈值，确认为同一物种，命名为S. frequens strain E49。

**（二）菌株E49的功能基因注释**

KEGG通路映射显示基因组含有完整反硝化基因集，包括硝酸盐还原酶基因（narGHI）、亚硝酸盐还原酶基因（nirS）、一氧化氮还原酶基因（norBC）和clade I氧化亚氮还原酶基因（nosZ），表明其具备完全反硝化至N₂的能力。基因组缺乏甲烷和甲醇氧化关键基因（pmoABC、mxaACDFGIJKL、xoxF），且厌氧实验未检测到CH₄消耗，确认该菌株不是甲基营养菌。此外，基因组编码完整的ectABCD-ask四氢嘧啶生物合成基因簇（ectA编码N-γ-乙酰转移酶，ectB编码L-2,4-二氨基丁酸转氨酶，ectC编码四氢嘧啶合酶，ectD编码四氢嘧啶羟化酶，ask编码天冬氨酸激酶），但缺乏四氢嘧啶降解基因（doeA、doeB），有利于渗透保护物质的细胞内积累。这是首次在S. frequens菌株中报道完整的四氢嘧啶生物合成基因簇。

**（三）菌株E49的形态学特征**

SYBR Green I染色和荧光显微镜观察显示，细胞呈直或略弯曲的杆状，长度1.5–2.5 μm，与已报道的Stutzerimonas物种形态一致。细胞分布均匀，无碎片或形态污染物。细胞常以小型聚集体出现，提示可能存在早期生物膜形成行为，但未进行特异性胞外聚合物（EPS）染色或生物膜分析。

**（四）N₂O还原的培养基依赖性调控**

通过三种培养方案比较（T1：预培养和活性测试均在DSMZ 1180培养基；T2：预培养在JCM 12、活性测试在DSMZ 1180；T3：两者均在JCM 12），发现N₂O消耗率以T1最高（4.59 ± 0.23 μmol-N₂O/h；0.71 ± 0.04 μmol-N₂O/mg-生物量/h），T2次之（降低约52%），T3最低（降低约91%）。TOC分析确认系统中残留有机碳可忽略（~0.012 mg/L），证明N₂O还原并非由外部或携带碳源驱动。DSMZ 1180为含30 g/L NaCl的无机矿物培养基且不含有机碳，而JCM 12含5 g/L NaCl和复合有机底物（蛋白胨、肉提取物）。盐度和碳源组成的差异可能共同影响N₂O呼吸活性，但两者的单独贡献尚无法区分。

**（五）菌株E49的N₂O还原性能**

在2.5小时培养后（OD₆₀₀ = 2.83 ± 0.07），菌株E49消耗11.5 ± 0.8 μmol-N₂O，平均消耗速率4.59 ± 0.13 μmol-N₂O/h，对应生物量比速率0.70 ± 0.02 μmol-N₂O/mg-生物量/h，细胞比速率7.93 ± 0.23 × 10^?10 μmol-N₂O/细胞/h。与已报道的N₂O还原菌相比，生物量比速率处于中低范围（如Azospira sp. I13为6.13，Shewanella loihica PV-4为26.8 ± 1.4 μmol-N₂O/mg-生物量/h），与活性污泥群落速率（1.16 ± 0.06 μmol-N₂O/mg-生物量/h）同数量级。值得注意的是，在无外部有机碳的严格碳限制条件下，菌株E49的细胞比速率超过了模式clade I nosZ反硝化菌Paracoccus denitrificans NBRC102528（5.01 ± 1.00 × 10^?10至5.10 ± 0.40 × 10^?10 μmol-N₂O/细胞/h），也高于若干clade II nosZ微生物。

**（六）乙酸盐添加对N₂O还原的影响**

微呼吸实验显示，在溶解氧耗尽后添加乙酸盐（终浓度625 μM）未引起N₂O还原曲线的明显变化，表明外部有机碳（乙酸盐）未刺激N₂O还原。随后添加JCM 12培养基和第二次N₂O剂量后，呼吸活性立即恢复，证实细胞在整个实验中保持代谢活性。对照实验确认Azospira sp. I13在乙酸盐添加后表现出明显呼吸响应，验证了实验系统能检测乙酸盐驱动的呼吸反应。因此，乙酸盐不太可能是支持菌株E49在测试条件下进行N₂O还原的主要外部电子供体。

**（七）N₂O还原的潜在电子供体**

KEGG通路分析显示菌株E49具有完整的乙酸盐同化途径（包括乙酸转运蛋白ActP、磷酸转乙酰酶pta、乙酸激酶ackA、琥珀酰-CoA:乙酸CoA转移酶aarC/cat1），但乙酸盐添加未增强N₂O还原，表明乙酸分解代谢并非限制因素。基因组缺乏完整的化学自养硫氧化途径、H₂氧化途径和Fe²⁺氧化途径，排除已知自养电子供体。基因组编码多磷酸盐激酶1（PPK1）和外切多磷酸酶（PPX），构成功能性多磷酸盐循环，可能通过多磷酸盐水解在有机碳受限时产生ATP维持细胞能量。然而，糖原生物合成途径不完整（缺乏glgC），聚羟基脂肪酸酯（PHA）合成和分解关键基因（phaB、phaC、phaZ）缺失，排除了这些储存聚合物作为碳/能源的可能性。研究人员推测内源储存物质（如多磷酸盐）可能提供能量，但直接还原力来源仍不明确，需要未来研究验证。

**五、研究结论**

本研究首次对从活性污泥中分离的N₂O还原细菌S. frequens strain E49进行了全面的基因组和生理学表征。该菌株基因组同时编码完整的反硝化途径（包括clade I nosZ）和完整的ectABCD-ask渗透保护物质合成基因簇，表明其具备呼吸与胁迫适应的组合能力。实验证明菌株E49在测定期间不依赖外部有机碳即可在厌氧条件下有效还原N₂O，凸显其作为生物N₂O汇的潜力。在不含外部有机碳条件下还原N₂O的能力代表了在寡营养或工程化系统（如废水处理）中应用的潜在优势。总体而言，这些发现扩展了对S. frequens生理学的认识，并支持进一步探索菌株E49在可持续N₂O减排和资源回收策略中的应用。该研究发表于《Applied and Environmental Microbiology》。