《Genes》：Mutations in Distal Cis-Regulatory Elements in the Beta Globin (HBB) Gene Promoter of Filipinos Influences Transcriptional Activity
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背景/目的：血红蛋白是红细胞中负责携带氧气的成分，由四条链组成，其中α珠蛋白和β珠蛋白各两条。编码β-珠蛋白链的β-珠蛋白（HBB）基因突变可导致β-地中海贫血。目前该遗传性疾病的常用诊断方法仅覆盖HBB基因的编码区。方法：通过计算机模拟预测HBB启动子远端区
背景/目的：血红蛋白是红细胞中负责携带氧气的成分，由四条链组成，其中α珠蛋白和β珠蛋白各两条。编码β-珠蛋白链的β-珠蛋白（HBB）基因突变可导致β-地中海贫血。目前该遗传性疾病的常用诊断方法仅覆盖HBB基因的编码区。方法：通过计算机模拟预测HBB启动子远端区域的顺式调控元件。通过PCR扩增和Sanger测序鉴定启动子变异，并评估HBB基因的表达水平。测量血液学参数，统计分析启动子变异、基因表达与血液学参数之间的关联。结果：测序显示预测的顺式调控元件中存在多种突变，这提示转录因子结合减少，可能导致HBB基因活性发生改变。基因表达分析进一步证实了这一点：启动子区域突变越多，HBB基因下调越显著，在血液学分析中表现为较低的平均红细胞体积（MCV）和血红蛋白（HGB）水平。在可能解释HBB表达降低的顺式调控元件突变中，包括影响TATA和GATA等转录因子结合的突变。结论：研究人员的工作揭示了将β-珠蛋白变异分析扩展至启动子区域的重要性，有助于理解常规诊断方法无法解释的地中海贫血性状的成因，从而制定适当的治疗策略。
**菲律宾人群HBB基因启动子远端顺式调控元件突变影响转录活性的研究解读**
β-地中海贫血是由HBB基因突变导致β-珠蛋白链合成减少或缺失的遗传性血液疾病，临床表现为小细胞低色素性贫血。目前常规分子诊断方法（如毛细管电泳和Sanger测序）主要针对HBB基因编码区，而启动子等调控区域通常未被纳入筛查范围。已有研究表明，HBB启动子区存在多个保守的顺式调控元件，如CACCC盒、CCAAT盒和TATA盒，这些元件对基因的精确转录调控至关重要。该区域突变可导致轻度的β?地中海贫血表型，甚至“沉默”携带者表型，使常规筛查无法有效识别。然而，不同人群中HBB启动子远端区域突变的频率及其功能影响仍缺乏系统研究。为弥补这一空白，研究人员以菲律宾人群为对象，分析HBB基因启动子远端顺式调控元件突变对转录活性及血液学参数的影响，旨在为不明原因的小细胞增多症和β-地中海贫血性状提供新的分子解释。
研究人员招募了10名菲律宾马科斯纪念州立大学（MMSU）的教职员工和学生，采集外周血样本，测量完整血细胞计数（CBC）参数，通过PCR扩增和Sanger测序鉴定HBB启动子远端区域（-750 bp至-200 bp）的序列变异，利用JASPAR CORE数据库预测顺式调控元件和转录因子结合位点（TFBS），并通过qPCR检测HBB和HBA2基因的mRNA表达水平。研究发现，预测的启动子远端区域存在高密度的调控元件簇，包括多个GATA结合基序和CACCC盒。在参与者中检测到25个序列变异，其中22个与预测的TFBS重叠，包括影响GATA2、GATA6等红系转录因子结合位点的突变。基因表达分析显示，启动子突变负担较高的个体HBB表达呈下降趋势，血液学参数中MCV和HGB相应降低。该研究提示HBB启动子远端区域的突变可能通过干扰转录因子结合来调节HBB转录活性，最终影响血液学表型。研究论文发表在《Genes》。
本研究采用的技术方法包括：从NCBI数据库获取HBB基因上游调控序列，使用JASPAR CORE数据库进行计算机模拟（in silico）预测顺式调控元件和TFBS。样本队列为菲律宾MMSU的10名参与者（60%为女性，年龄22–41岁）。通过PCR扩增HBB启动子远端区域并进行Sanger测序鉴定序列变异，使用Clustal Omega进行序列比对。采用酚-氯仿法提取外周血网织红细胞总RNA，反转录合成cDNA，使用定量实时PCR（qPCR）检测HBB和HBA2基因表达，以ACTB为内参，采用2
?ΔΔCt法计算相对表达量。使用全自动血液分析仪测量HGB、RBC、MCV和MCH。统计学分析采用独立样本t检验、单因素方差分析（ANOVA）和Tukey事后多重比较。
研究结果部分如下：
**3.1 参与者的人口学特征**：共纳入10名菲律宾参与者，其中女性6人（60%），男性4人（40%）；年龄范围22–41岁，平均年龄32±6.78岁。该样本量较小，属于探索性研究。
**3.2 HBB基因启动子中预测的顺式调控元件**：通过计算机预测，在-750至-200 bp区域共检测到300个TFBS，包括多个与红系分化相关的GATA结合基序，以及SPI1、FL1和ELF1等转录因子结合位点。在-110至-70 bp区域发现14个CACCC盒，此外还预测到MYB、ETS1和SPI等位点。结果提示远端启动子区域是一个高密度的调控域。
**3.3 HBB基因的血液学特征和转录活性**
**3.3.1 不同参与者间的CBC参数差异**：参与者平均HGB为121.3 g/L，平均MCV为77.89 fL，平均MCH为25.14 pg。根据MCV将参与者分为高（≥80 fL）、中（71–79 fL）、低（≤70 fL）三组，分别对应正常、轻度小细胞和严重小细胞表型。统计显示高与中、中与低MCV组间存在显著差异（p<0.05或p<0.01），MCH也呈现类似趋势。
**3.3.2 HBB和HBA2基因在不同MCV定义组中的差异表达**：qPCR结果显示，HBA2表达在高和中MCV组中最高，在低MCV组中急剧下降，且低MCV组与另外两组差异显著（p<0.01）。HBB表达则表现出从高到低MCV组的轻微下降趋势，但差异未达统计学显著。结果提示HBA2表达的剧烈变化可能影响MCV分组，而HBB表达变化相对温和。
**3.4 HBB基因启动子的突变**：Sanger测序在10名参与者中的2名（U08和U09）中识别出25个序列变异，包括单核苷酸替换、插入和缺失。变异分布在-703、-551、-528、-340、-336等位置，尤其在-270至-240 bp区域形成突变簇。U09变异数目多于U08，且包含连续三个缺失突变（-249、-248、-247）。结果提示启动子区域存在多态性和潜在功能变异。
**3.5 受突变影响的转录因子**：在U08中，-703 T>C杂合突变位于预测的GATA2和GATA6结合位点内；U09中-245 G>A、-243 A>G、-242 T>A、-241 G>T四个变异均与一个预测的GATA2结合基序重叠。此外，部分变异影响FOX、ZNF、HOX等非经典红系转录因子家族的结合位点。结果表明，这些突变可能通过破坏转录因子结合来干扰HBB的转录调控。
讨论部分指出，本研究为HBB启动子远端顺式调控元件变异参与调节转录活性并影响血液学表型提供了证据。启动子区域密集分布的TFBS，尤其是GATA基序簇，提示远端调控元件在红系基因表达中的重要性。突变与TFBS重叠，特别是GATA和CACCC位点的破坏，可能降低转录因子结合效率，导致HBB表达下调。基因表达虽然未达显著，但方向性一致。HBA2表达在低MCV组显著降低，提示可能存在α/β珠蛋白平衡的补偿机制。现有诊断策略忽视调控区域，易漏检轻度或沉默表型，因此应扩展至启动子分析。本研究局限性包括样本量小、来自单一机构、仅分析远端启动子区域，且未进行启动子活性的功能验证。
研究结论部分翻译如下：本研究证明，HBB基因启动子远端顺式调控元件内的突变与层叠的转录活性改变及血液学参数的细微变化相关。尽管存在上述局限性，这些发现强调了调控区域在β-珠蛋白基因表达遗传结构中的重要性，并支持将启动子分析纳入诊断策略，以改善地中海贫血相关表型的检测和特征描述。
