通过3D打印金属平台实现双重代谢检查点阻断重塑肿瘤生态系统以激发系统性抗肿瘤免疫

《Bioactive Materials》：Dual metabolic checkpoint blockade via a 3D-Printed metalloplatform remodels the tumor ecosystem for systemic antitumor immunity

　　

摘要：免疫抑制性肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）限制了靶向代谢的肿瘤治疗策略的疗效。本文展示了一种双重代谢调控策略，同时重编程肿瘤细胞中的糖酵解和肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages，TAMs）中的果糖代谢，从而将代谢生态系统从促肿瘤状态转变为抗肿瘤状态，并激发系统性免疫应答。通过泛癌单细胞分析，研究人员鉴定出一种代谢分工现象：肿瘤细胞表现出过度活跃的糖酵解，而免疫抑制性巨噬细胞则表现出升高的果糖代谢。研究人员发现锰离子（Mn²⁺）选择性地对糖酵解具有潜在抑制作用，可诱导细胞焦亡（pyroptosis），但矛盾的是，在M2样巨噬细胞中会上调果糖代谢，从而产生可利用的代谢脆弱性。为利用这种双重活性，研究人员设计了一种3D打印纳米多孔Cu-Mn合金（CuMn），该合金可持续瘤内释放Mn²⁺并递送果糖激酶抑制剂。在双侧乳腺癌模型中，单次瘤内植入该平台可抑制原发肿瘤生长并根除远处未治疗病灶。治疗疗效与巨噬细胞重编程相关，从而重塑免疫微环境、缓解T细胞耗竭并抑制远处肿瘤生长，提示其具有系统性抗肿瘤效应。该纳米平台的局部递送为克服肿瘤免疫抑制和增强癌症免疫治疗提供了一种策略。

**论文解读：基于3D打印金属平台的双重代谢检查点阻断策略重塑肿瘤生态系统并激发系统性抗肿瘤免疫**

**一、研究背景与问题**

靶向肿瘤细胞内在代谢通路（如葡萄糖转运蛋白1（GLUT1）抑制剂）虽然在部分血液系统恶性肿瘤中显示出临床获益，但在大多数实体瘤中的疗效仍十分有限。其主要障碍在于免疫抑制性肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）深刻地影响了不同细胞类型间的代谢串扰。实体肿瘤并非简单的恶性细胞聚集体，而是由基质细胞和免疫细胞动态塑造代谢互作、影响治疗应答的高度异质性生态系统。肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages，TAMs）是TME中最丰富的免疫细胞群之一，其促肿瘤M2与抗肿瘤M1极化状态与其代谢状态密切相关。因此，靶向TAM代谢是重塑免疫抑制TME、增强抗肿瘤免疫的一种有前景的策略。既往研究已鉴定出M2样巨噬细胞对果糖代谢的独特代谢依赖性，果糖激酶（ketohexokinase，KHK）在TAMs中显著上调并与免疫抑制标志物相关，提示果糖代谢可作为TAMs的代谢检查点，具有逆转其促肿瘤功能的应用潜能。锰离子（Mn²⁺）在金属免疫学中因能激活cGAS-STING通路而受到关注，但对其是否直接影响肿瘤细胞代谢尚不清楚。鉴于肿瘤细胞对糖酵解的成瘾性，研究人员推测Mn²⁺可能通过代谢干扰发挥此前未被认识的抗肿瘤活性。

**二、研究目的与核心发现**

本研究旨在利用肿瘤细胞与免疫抑制性免疫细胞各自特有的代谢脆弱性，实现同时靶向两种细胞群的协同治疗策略。研究人员通过泛癌代谢谱分析发现了一种显著的分工：肿瘤细胞表现出过度活跃的糖酵解，而M2样TAMs显示升高的果糖代谢。意外的是，Mn²⁺抑制肿瘤细胞的糖酵解，却同时增强M2巨噬细胞的果糖代谢，这种差异性应答揭示了一个可用于治疗干预的代谢脆弱性。为实现这一双重靶向，研究人员设计并制备了一种负载KHK抑制剂KHK-IN-2（KHKi）的3D打印纳米多孔CuMn金属平台（CuMn-K），提出“代谢检查点阻断”策略——解除肿瘤细胞中糖酵解和TAMs中果糖代谢这两个限速代谢节点，在概念上类似于免疫检查点解除T细胞抑制信号。机制研究表明，Mn²⁺处理与糖酵解活性降低及肿瘤细胞焦亡诱导相关，而KHKi通过JAK-STAT1/STAT5通路将M2巨噬细胞重编程为M1样表型。在双侧4T1乳腺癌模型中，单次瘤内植入CuMn-K可重塑TME、缓解T细胞耗竭并抑制远处肿瘤生长。该研究建立了超越单细胞类型靶向、迈向生态系统层面代谢重编程的新概念框架，为下一代癌症免疫治疗提供了整合代谢与免疫调节的新方向。该论文发表于《Bioactive Materials》。

**三、主要关键技术方法**

该研究采用了多种关键技术：利用癌症基因组图谱（TCGA）数据库进行泛癌离子代谢通路分析；使用多个独立单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据集（包括HNSC、MELA、COAD、BRCA等队列）进行代谢通路活性评分与相关性分析；通过激光粉末床熔融（LPBF）3D打印技术制备CuMn合金前体，并采用化学脱合金工艺构建纳米多孔结构；利用高效液相色谱（HPLC）和电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）表征药物负载与离子释放。体内实验使用免疫健全Balb/c小鼠双侧4T1乳腺癌模型及MC38结直肠癌模型，并通过氯膦酸盐脂质体和中和抗体构建巨噬细胞、CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞耗竭模型。

**四、研究结果**

**4.1 Mn²⁺潜在抑制糖酵解并诱导肿瘤细胞焦亡**

通过TCGA数据库分析发现，Mn²⁺在肿瘤组织中的代谢水平高于正常组织。三个scRNA-seq数据集的关联分析显示，肿瘤细胞中Mn代谢通路表达与增殖及细胞周期评分呈负相关。CCK8实验表明，Mn²⁺以浓度依赖方式显著抑制肿瘤细胞活力。RNA测序及KEGG通路富集显示，Mn²⁺处理下调糖酵解相关基因；细胞形态学观察及Western blotting（WB）检测发现Mn²⁺处理诱导细胞肿胀和焦亡小体形成，并上调cleaved caspase1和GSDMD-N的表达，提示Mn²⁺可能通过干预糖酵解代谢抑制肿瘤细胞增殖并诱导焦亡。

**4.2 Mn²⁺差异调控巨噬细胞代谢并揭示M2细胞的可靶向脆弱性**

scRNA-seq分析显示，巨噬细胞是第二高代谢活性的细胞群，以果糖代谢为主要碳水化合物代谢途径。Mn²⁺处理抑制M2样巨噬细胞糖酵解基因表达的同时，显著上调果糖代谢关键酶KHK的表达。多重免疫荧光（mIF）染色显示，KHK高表达巨噬细胞周围区域PD1⁺CD4⁺T和PD1⁺CD8⁺T细胞浸润比例更高，表明高果糖代谢巨噬细胞与T细胞免疫抑制表型相关。

**4.3 3D打印纳米多孔CuMn合金实现持续双重代谢检查点阻断递送**

通过LPBF 3D打印技术制备Cu-54 wt% Mn合金前体，经化学脱合金选择性地去除胞内Mn富集区，形成具有纳米多孔网络与致密骨架的CuMn平台。该平台具有约3.9 nm的介孔结构、2.63 wt%的KHKi负载率，并可持续释放药物（48小时释放68.5%）和Mn离子，而Cu离子释放可忽略不计，确认生物活性主要由Mn介导。

**4.4 CuMn-K体外协同重编程肿瘤细胞与巨噬细胞代谢**

代谢组学与转录组分析显示，CuMn和CuMn-K处理显著抑制肿瘤细胞糖酵解，降低乳酸产量，并诱导典型的焦亡形态学特征，该效应在低氧条件下可部分逆转。在巨噬细胞方面，KHKi和CuMn-K均能抑制M2极化并诱导M1极化，其中CuMn-K处理显著上调IRF3表达及STAT1、STAT5和p65磷酸化水平，表明可激活广泛的免疫信号通路。单独的CuMn处理虽然改变M2巨噬细胞代谢基因表达，但不足以驱动从M2到M1的表型转化，强调KHKi在功能性重极化中的关键作用。

**4.5 CuMn-K体内重塑肿瘤微环境并抑制原发和远处肿瘤**

在双侧4T1肿瘤模型中，CuMn和CuMn-K瘤内植入均显著抑制原发和远处肿瘤生长，其中CuMn-K对远处肿瘤的抑制作用更为突出。流式细胞术和IF染色显示，CuMn-K处理组M1巨噬细胞比例升高、M2比例下降，Treg和耗竭性T细胞（Tex）比例降低，血清中Ifn-γ和Tnf-α水平升高。在MC38结直肠癌模型中亦观察到一致的肿瘤生长抑制效果。CuMn和CuMn-K植入物具有良好生物降解性和生物安全性。

**4.6 CuMn-K通过重编程TAM果糖代谢激发系统性抗肿瘤免疫**

巨噬细胞耗竭实验中，当巨噬细胞被清除后，CuMn-K相对于CuMn的治疗优势消失，证实巨噬细胞是CuMn-K抗肿瘤效应的关键介质。CD4⁺T和CD8⁺T细胞耗竭模型及mIF分析显示，CuMn-K处理后KHK⁺巨噬细胞比例显著降低，且PD1⁺CD8⁺T细胞和PD1⁺CD4⁺T细胞的浸润与KHK⁺巨噬细胞比例高度相关（R=0.52–0.62），表明TAM果糖代谢重编程可对CD4⁺和CD8⁺T细胞均产生免疫复兴效应。

**五、讨论总结与研究结论**

讨论部分指出，Mn²⁺除了激活cGAS-STING通路外，还能直接抑制肿瘤细胞糖酵解，这一直接杀瘤机制与STING介导的免疫激活在机制上不同但可能互补。单细胞分析揭示的TME代谢分工——肿瘤细胞主导糖酵解而TAMs依赖果糖代谢——可能反映了TME中葡萄糖优先被肿瘤细胞消耗，迫使免疫细胞利用果糖等替代碳源的适应性。KHK抑制驱动M1极化的机制可能与JAK-STAT1/STAT5信号轴激活有关，但果糖分解代谢与STAT激活之间的精确分子机制仍有待进一步研究。该3D打印纳米多孔CuMn平台具有低Cu释放、良好生物降解性和可行性，并设想了新辅助治疗和局部晚期不可手术肿瘤等临床场景。研究局限性包括使用永生化巨噬细胞系、对表观遗传机制的了解有限、仅在免疫健全小鼠中评估以及14天观察窗口内支架未完全吸收等。总而言之，本研究提出了一种双重代谢检查点阻断策略，同时重编程肿瘤细胞的糖酵解和TAMs的果糖代谢，从而重塑肿瘤微环境并激发持久的系统性抗肿瘤免疫。研究发现了Mn²⁺作为潜在糖酵解抑制剂的新功能，验证了TAM果糖代谢作为治疗靶点的可行性，并展示了一种工程化3D打印平台实现协同代谢干预的能力，为癌症代谢治疗从单细胞类型靶向向生态系统层面代谢重编程的范式转变奠定了基础。