无需标签和酶的电化学DNA生物传感器，用于超灵敏检测乳腺癌预后标志物ESR1

《Bioelectrochemistry》：Label- and- enzyme free electrochemical DNA biosensor for ultrasensitive detection of breast cancer prognostic marker ESR1

　　**摘要**
乳腺癌是一种复杂的异质性疾病，持续对全球女性健康造成重大负担。通过非侵入性液体活检分析ESR1基因表达具有显著的预后价值，可作为ER+/HER-2?（雌激素受体+/人表皮生长因子受体-2?）乳腺癌患者预后不良和总体生存率（OS）的指标。这突显了开发可靠疾病监测方法的必要性。然而，现有的检测方法难以同时实现简便性、快速分析、高精度和成本效益，因此需要DNA生物传感器。本文采用紫外激光诱导的石墨烯（UV-LIG）电极，通过激光刻划经过紫外-臭氧处理的聚酰亚胺薄膜制备而成，这种电极具有亲水性活化表面，能够增强阳离子聚-L-赖氨酸（PLL）的吸附。基于UV-LIG的DNA生物传感器的成功制备通过扫描电子显微镜（SEM）、透射电子显微镜（TEM）和X射线光电子能谱（XPS）分析得到验证。在优化条件下，计时安培测量显示电流密度响应与ESR1目标浓度对数之间存在明确的线性关系，检测限为2.5 aM，定量限为8.3 aM，且无需任何标记步骤。该生物传感器在血清分析中也表现出令人满意的性能，证明了其对基质干扰的鲁棒性。此外，它在区分单核苷酸错配方面表现出优异的选择性。

**引言**
乳腺癌是全球女性中最常见的恶性肿瘤，其在早期诊断和预后准确性方面的生物标志物识别仍面临诸多挑战[1]。据估计，2025年全球新增乳腺癌病例约230万例，死亡人数67万例，使其成为仅次于肺癌的第二大常见癌症，并位列癌症死亡原因的第四位[2]。该疾病的异质性源于基因组、表观基因组、转录组和蛋白质组等多个分子层面的变异，这些变异共同导致了疾病进展、临床复发和治疗抵抗性的出现[3]。根据ER、PR和HER2表达情况，乳腺癌可分为三种主要亚型：HR+、HER2阳性和三阴性[4]。最常见的亚型是HR+/HER2?肿瘤，占所有乳腺癌诊断的70%，其特征是表达雌激素受体（ERs）和/或孕激素受体（PRs）[5]。ERα由ESR1基因编码，ESR1的高表达水平与乳腺癌患者的预后不良相关[6] [7]。此外，ESR1及其他分子靶标（如PGR、EGFR和ERBB2）的表达水平与患者的总体生存率显著相关，表明它们具有作为预后指标的潜力[8] [9] [10] [11]。在高离子强度生物流体（如血清或血浆）中准确检测核酸生物标志物具有重要的临床意义[12]。尽管这些流体的复杂性带来了挑战，但在这些条件下实现可靠检测对于推进液体活检技术至关重要，液体活检是一种有前景的非侵入性诊断方法，有望取代传统的组织活检[7] [12] [13]。目前的基因表达检测方法包括实时PCR、Northern印迹和微阵列[14] [15] [16]，但这些方法在床旁检测（POCT）方面存在局限性：Northern印迹结果虽然可靠，但灵敏度较低且操作繁琐；RT-PCR虽然灵敏度和特异性高，但需要大型昂贵设备，适用于资源有限的环境较为困难[17]；微阵列在高通量分析方面表现优异，但常因灵敏度和特异性不足而受限[18]。因此，迫切需要开发一种替代方法，直接从生物样本（如血清）中检测癌症相关生物标志物。

**电化学基因传感**
电化学基因传感是一种将分子生物学策略与电化学方法结合的新兴分析技术，用于检测核酸序列。该技术具有快速响应、高灵敏度和选择性强等优点，特别适用于临床应用，因为其便携性强、能够同时检测多个靶标，并且成本效益较高[19]。其工作原理基于互补DNA或RNA序列之间的选择性分子识别[20]。典型的电化学基因传感器包括三个核心部分：识别元件（通常为捕获目标核酸的DNA或RNA探针）、作为换能器的支撑电极以及测量和解释目标结合时产生的电化学响应的信号处理单元[21]。通过可扩展的激光直接书写技术对聚酰亚胺基底（PI）进行聚合解构，是制备UV-LIG的有效方法[22]，这种电极平台因相对简单、成本低廉、表面积大、导电性强、内在噪声低且易于使用而具有广泛应用前景[23] [24]，适合用于DNA生物传感器制造并实现大规模生产。紫外-臭氧处理通过将臭氧分子插入双层石墨烯之间，克服了LIG电极的疏水性问题，从而增加了电极的活性表面积并提升了传感性能[26]。聚-L-赖氨酸（PLL）是一种天然存在的肽类物质l-赖氨酸的生物聚合物[27]，其密集排列的阳离子基团可与阴离子物质强烈相互作用[28]。在生物传感应用中，PLL具有多种优势，可在短时间内与核酸、蛋白质和石墨烯实现良好的分子兼容性[28]。

**本研究**
我们开发了一种基于电化学DNA UV-LIG的传感器。在激光刻划之前，使用UVO处理对PI薄膜表面进行活化与清洗。构建UV-LIG工作电极后，通过PLL薄膜对传感区域进行功能化处理，随后使用双功能交联剂戊二醛（GA）进行稳定。为防止GA过度交联，采用甘氨酸溶液进行淬火处理。随后，通过静电相互作用将未修饰的单链DNA探针固定在修饰电极表面。利用这一设计，仅需1.8 μL的真实血清样本，仅需30分钟即可成功检测到ssESR1目标序列，无论是在灭菌的合成缓冲液中还是在生物环境中。据我们所知，这是首次开发出用于快速检测乳腺癌预后标志物ESR1转录本的简单DNA生物传感器，并为10 aM至1 nM的广泛浓度范围内的定量提供了潜在平台。

**材料**
MOPC纯化的合成DNA购自Macrogen公司（韩国），为冻干形式（表1）。本研究使用的所有序列均未进行任何修饰。所有缓冲液的制备均使用Millipore Milli-Q水纯化系统所得的超纯水（≥18.25 MΩ）。寡核苷酸制备前，超纯水还通过0.2 μm超滤膜（DN0056K）去除热原、核酸酶和蛋白酶。

**DNA生物传感器的构建原理**
本研究开发了一种用于ESR1检测的生物传感平台，包括传感区和电气连接区。传感芯片的检测原理如图1所示。首先，紫外-臭氧处理使LIG表面变得更具亲水性（通过接触角验证），这增强了生物材料在其表面的附着性[25] [29]，同时促进了快速响应。

**结论**
本研究报道了一种基于PLL-UV-LIG的低密度电化学DNA生物传感器，可在30分钟内实现ESR1序列的超灵敏检测，无需依赖酶促信号检测、扩增或标记步骤。在该传感平台上，GA在高度导电的UV-LIG表面形成的稳定PLL层作为未修饰22-nt序列DNA探针的固定支架。

**人类和生物材料**
本研究使用了转移性乳腺癌（MBC）患者和健康志愿者的血液样本。所有使用的生物材料均获得了捐赠者或其亲属或法定代表的同意，用于本研究及文章发表。本研究中使用的样本均非来自已处决的囚犯或良心囚犯。

**人类研究**
本研究遵循所在地区的相关法律、监管框架和指南进行。该研究获得了亚历山大大学医学院医学伦理委员会的批准（批准号FSRP-014-02）。

**作者贡献声明**
Alaa Abdelmohaymen Khalil：撰写 – 审稿与编辑、原始草稿编写、软件开发、方法设计、数据分析、数据管理；Waleed Arafat：监督、资源提供、概念构思；Ahmed Fath El-Bab：监督、资源提供、数据分析、概念构思；Ahmed Osman：撰写 – 审稿与编辑、监督、资源提供、数据分析、概念构思；Ahmed Abd El-Moneim：撰写 – 审稿与编辑、验证、监督、资源提供、概念构思。

**知情同意与患者信息**
所有参与者或其法定代表均已提供书面知情同意书，同意参与研究并同意文章发表。参与者的隐私权得到了保障。

**伦理声明**
本研究获得了亚历山大大学El Miri医院医学伦理委员会的批准，所有参与者均签署了知情同意书，并遵循赫尔辛基宣言开展研究。

**资助**
本研究未获得外部资金支持。

**利益冲突声明**
作者声明以下可能的财务利益/个人关系可能构成利益冲突：Ahmed Abd El-Moneim表示设备由科学技术与创新资助局提供。如有其他作者，他们也声明没有已知的可能影响本文工作的财务利益或个人关系。

**致谢**
我们衷心感谢埃及-日本科技大学的能源与电子应用石墨烯卓越中心（ID 31306）在本研究中的持续支持，该中心得到了埃及科学技术发展基金（STDF）的资助。第一作者还要感谢教育部提供的博士学位奖学金，以及E-JUST生物技术部门的协助。