BMP9处理的胶原支架通过调节牙周韧带来源的干细胞（PDLSCs）和巨噬细胞的微环境来促进牙周组织再生

《Biomaterials》：BMP9-Loaded Collagen Scaffold Promotes Periodontal Regeneration via Microenvironmental Modulation of PDLSCs and Macrophages

　　

摘要

牙周组织再生需要多种细胞类型、支持性基质成分以及信号蛋白（包括骨形态发生蛋白（BMPs）之间的协调响应。尽管对BMP2进行了大量研究，但BMP9在骨和牙龈修复中的再生作用及其与BMP2的相互作用仍知之甚少。值得注意的是，BMP9独立于拮抗剂Noggin，分子动力学模拟证实，在牙周韧带干细胞（PDLSCs）中，Noggin–BMP9复合物表现出更大的均方根偏差（RMSD）值和不稳定的相互作用。功能上，BMP9显著增强了PDLSCs的成骨和成水泥细胞分化，最小化了破骨细胞的活化，并通过减轻应激诱导的凋亡和保持线粒体膜电位来改善PDLSCs和巨噬细胞的存活。BMP9还诱导了上皮-间充质转化（EMT），并与内源性基质蛋白协同作用以增强矿化。为了优化BMP在应用部位的定位，尝试了海绵状胶原支架。比较了用碳二亚胺（EDC/NHS）和脱水热（DHT）交联的I型胶原海绵，最终选择DHT交联的海绵，因为它具有更大的孔隙、更高的吸水性和更高的BMP9载药效率。

在犬牙周缺损模型中，负载BMP9的DHT-胶原海绵促进了牙龈、牙周韧带和牙槽骨的整合再生，同时伴有与PDLSCs和巨噬细胞相关的ApoBD样结构。转录组分析显示与EMT和牙骨质生成相关的基因集显著上调，强调了BMP9在驱动牙周组织稳态中的作用。总体而言，这些发现表明通过胶原海绵传递高亲和力的BMP9是一种有效且可临床转化的牙周组织再生策略。

引言

牙周再生涉及一系列高度协调的事件，需要多种细胞类型、生长因子和蛋白质来重新构建功能健全的牙槽骨、牙龈、牙周韧带和牙龈。特别值得关注的是牙周韧带间隙，其中包含牙周韧带干细胞（PDLSCs）、Malassez上皮细胞rests（ERMs）、骨唾液蛋白、骨形态发生蛋白（BMP）家族成员、牙尖来源的干细胞、牙本质唾液磷酸蛋白（DSPP）、牙龈基质蛋白（CEMP1）、破骨细胞和巨噬细胞等[1]、[2]、[3]、[4]、[5]、[6]、[7]。牙本质基质成分也在驱动牙骨质生成中起关键作用，因此在牙周组织修复中起调节作用[6]、[7]、[8]。

BMP9因其在体外和动物模型中的显著成骨效应而受到关注[9]。最近的研究表明，BMP9可能在促进牙槽骨和牙周韧带再生方面优于BMP2[10]，并且BMP9可以诱导牙尖乳头和牙周韧带干细胞的成骨细胞和成牙本质细胞分化[11]、[12]。这些发现共同表明BMP9是牙周再生的一个有前景的调节因子[13]。Noggin是一种公认的BMP信号传导的细胞外拮抗剂，通过直接结合BMP配体并限制受体的有效结合来抑制成骨活性。由于内源性BMP拮抗作用可能限制受伤组织中的再生信号强度和持续时间，因此配体对Noggin的特异性敏感性在机制上具有重要意义。包括我们之前的工作在内的最新研究表明，与BMP2相比，BMP9相对抵抗Noggin的抑制，在Noggin暴露下仍能保持受体结合和下游信号传导[14]。这为我们在PDLSCs中初步比较BMP2和BMP9提供了机制上的依据。

特别是，基于人工智能（AI）的模拟方法和转录组分析关于BMP9在牙周再生中的机制作用的潜在见解尚未得到充分探索。此外，了解牙周细胞谱系层次结构和单细胞水平的细胞间通信越来越被认为是阐明牙周再生基本机制的关键[15]。

BMP必须在中位点保留足够长的时间，以指导组织修复的各个阶段。因此，传递策略集中在能够调节蛋白质释放动力学的生物材料载体上。已报道了四类主要的载体：磷酸钙陶瓷、合成聚酯（例如聚（乳酸-羟基乙酸）（PLGA））、天然来源的基质（如胶原）以及复合杂交材料，每种载体都具有不同的释放动力学和处理特性[16]。比较研究和系统评价一致表明，能够持续释放BMP数天而非几分钟或几小时的载体可以实现更好的骨和牙周再生，并且可以使用更低的蛋白质剂量[17]。

在各种生物材料传递策略中，可吸收的I型胶原海绵（ACS）在临床上应用最为成熟。当重组人BMP2吸附在ACS上时，这种构建物表现出良好的“爆发释放-持续释放”特性，初始释放阶段可吸引前体细胞，随后是缓慢释放，在七天内约有三分之一的剂量保留在损伤部位；这种保留率比不使用载体的蛋白质高十倍以上[18]。胶原具有生物相容性、可塑性，并已获准用于口腔和骨科应用，使其成为评估本研究中显示的BMP9增强成骨效力的理想载体。对于胶原支架的交联，比较了碳二亚胺（EDC/NHS）和脱水热（DHT）方法，最终选择DHT交联的海绵作为BMP9载体，因为它具有更大的孔隙、更高的液体吸收性和更大的载药能力。

在这里，我们研究了BMP9在牙周伤口愈合中的独特生物医学功能和作用机制，并评估了通过胶原海绵传递BMP9是否能更有效地协调成功牙周组织再生所需的细胞和分子成分。

章节摘录

胶原支架和交联

使用2.2 wt%的猪I型胶原海绵（冻干）作为两种交联方案的基础基质。对于EDC交联，将胶原海绵浸入0.03 M EDC·HCl溶液中（该溶液在99.9%乙醇中制备（E7750-25G；Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯），室温下轻轻搅拌24小时，然后每次用去离子水冲洗6小时，最后冻干。对于DHT交联，将胶原海绵（Regenomer?，NIBEC，韩国金泉）在140°C下烘烤72小时

BMP9–Smad1/5/9信号通路对Noggin介导的抑制的相对抗性

为了比较BMP2和BMP9对Noggin的敏感性，我们首先使用ChimeraX（APBS插件）进行电静力映射模拟，并在NAMD 2.14中使用CHARMM 36力场进行100-ns全原子MD模拟（图1）。关于BMP–Noggin复合物，电静力分布显示在界面处（如箭头所示）存在更强的电静力相互作用

讨论

在牙周再生过程中，初始阶段包括血凝块形成，随后是肉芽组织的发展。在此期间，结合上皮在牙龈下增殖，牙龈成纤维细胞发生分化和增殖。这两种细胞群体之间的相互作用和竞争被认为是成功牙周组织再生的关键因素。我们的periostin抗体和共聚焦成像分析揭示了

结论

总之，BMP9能够在不受Noggin介导的抑制的情况下促进强劲的牙周再生，这一点得到了基于ALK1的MD模拟的支持，该模拟显示PDLSCs中的受体构象具有灵活性。此外，BMP9增强了成骨作用、上皮-间充质转化（EMT）和牙骨质生成，并调节PDLSCs和巨噬细胞的凋亡。与促进明显破骨细胞生成的BMP2不同，BMP9减弱了破骨细胞活性，同时促进了ApoBD样结构的形成。

CRediT作者贡献声明

Chong Pyung Chung：撰写 – 审稿与编辑、监督、正式分析、概念构建。 Jin Wook Yang：资源获取、实验研究。 Hyunjae Kim：方法学、实验研究。 Yang Jo Seol：方法学、概念构建。 Suhyun Park：软件使用、正式分析。 Sungtae Kim：方法学、概念构建。 Hee-seung Han：方法学、实验研究。 Jue-Yeon Lee：撰写 – 审稿与编辑、监督、资源获取、正式分析、概念构建。 Dong

伦理批准和参与同意

所有动物实验均符合ARRIVE 2.0指南和《实验室动物护理和使用指南》。实验得到了韩国首尔国立大学动物护理和使用委员会（IACUC）的批准（220914-6）。

利益冲突声明

作者没有需要声明的利益冲突。

数据可用性

支持本研究的转录组数据集已存放在NCBI基因表达组数据库（GEO）中，访问号为GSE293730，并将在论文发表时公开。本研究生成的所有数据都包含在本手稿和补充图中。

资助

本研究得到了韩国国家研究基金会（NRF）通过基础科学研究计划（由教育部资助）的支持（2021R1A6A1A03039462）

利益冲突声明

作者声明以下可能的财务利益/个人关系：Yoon Jeong Park报告称获得了韩国国家研究基金会（NRF）的财务支持。如果有其他作者，他们声明没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。

Dong Woo Lee | Hee-seung Han | Yu-Bin Kim | Sanghui Seok | Gookjin Yoon | Hyunjae Kim | Jin Wook Yang | Suhyun Park | Yang Jo Seol | Sungtae Kim | Sangwook Wu | Young-Dan Cho | Jue-Yeon Lee | Yoon Shin Park | Yoon Jeong Park | Chong Pyung Chung 中央研究院，纳米智能生物医学工程公司（NIBEC），韩国首尔03127