混合噬菌体水凝胶可清除肿瘤内的细菌，从而增强溶瘤免疫疗法的效果

《Biomaterials》：Hybrid bacteriophage hydrogels deplete intratumoral bacteria to potentiate oncolytic immunotherapy

　　

摘要

溶瘤病毒作为一种原位癌症疫苗，通过诱导抗原释放来增强抗肿瘤免疫。特定的肿瘤内细菌会加剧免疫抑制；然而，它们对溶瘤免疫疗法的影响仍不清楚。在这里，我们报告了一种由工程化的溶瘤M13噬菌体（eM13）和大肠杆菌（E. coli）噬菌体Tequatrovirus YZ2组成的杂合细菌噬菌体水凝胶，这种水凝胶通过选择性清除肿瘤内的E. coli来增强抗肿瘤免疫，从而抑制乳腺癌的进展和转移。特别是，YZ2与光敏剂CyI结合形成YZ2-CyI（YC），并通过使用pH敏感的配位分子将YC和eM13交联形成动态席夫碱键来制备这种水凝胶。在酸性的肿瘤微环境中，eM13和YC分别逐渐释放，以实现靶向溶瘤作用和E. coli的清除。肿瘤内细菌的清除增强了树突状细胞和CD8⁺ T细胞的活性，同时抑制了免疫抑制性的M2巨噬细胞、调节性T细胞和髓系来源的抑制细胞。在低免疫原性的三阴性乳腺癌模型中，清除肿瘤内的E. coli有助于提高溶瘤疗法对肿瘤进展、复发和转移的疗效。值得注意的是，这种噬菌体制剂具有良好的安全性，不会破坏肠道微生物群的平衡。这些结果支持其在微生物群浸润性肿瘤中的潜在临床应用，并能够改善溶瘤免疫疗法的效果。

引言

溶瘤病毒（OVs）疗法利用病毒选择性感染并裂解肿瘤细胞，同时不伤害正常组织[1],[2],[3],[4]。通过强烈的肿瘤内复制，OVs直接破坏恶性细胞，并关键地诱导免疫原性细胞死亡（ICD）[5]。这一过程释放肿瘤相关抗原（TAAs），从而增强树突状细胞（DCs）的抗原呈递并激活细胞毒性T淋巴细胞，进而建立全身性的抗肿瘤免疫反应[6]。几种OVs，如H101（腺病毒）、T-VEC（单纯疱疹病毒）和Rigvir（肠道细胞病变性人类孤儿病毒），已在多种癌症中显示出临床益处[7],[8],[9]。然而，肿瘤可以通过招募免疫抑制细胞（包括调节性T细胞（Tregs）、髓系来源的抑制细胞（MDSCs）和M2型肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）来创建一个免疫抑制性的肿瘤微环境（ITME）[10],[11]，从而逃避免疫攻击[10],[11]。这种抑制显著限制了溶瘤免疫疗法的疗效。因此，克服肿瘤诱导的免疫抑制是提高溶瘤免疫疗法疗效的关键策略。

最近的研究发现肿瘤内细菌是肿瘤微环境（TME）的一个新兴组成部分，这挑战了最初认为肿瘤组织是无菌的假设[12],[13],[14]。进一步的研究表明这些细菌在调节癌症免疫中起着关键作用[15],[16]。例如，乳杆菌有助于在食管鳞状细胞癌中创建ITME[17]。在口腔鳞状细胞癌中，Fusobacterium nucleatum促进M2型TAMs的极化，从而促进ITME的形成[18]。此外，Fusobacterium nucleatum表达的Fap2[19]与免疫细胞（如NK细胞和T细胞）上表达的免疫球蛋白和免疫受体酪氨酸基抑制基序结构域的相互作用，抵抗了NK细胞对人类肿瘤细胞的杀伤，进一步促进了结直肠癌的ITME[20]。与其他恶性肿瘤相比，乳腺癌中的细菌数量更高[14]。在乳腺癌中丰富的变形菌门大肠杆菌（E. coli）菌株会减少T细胞和M1型肿瘤相关巨噬细胞（TAM）的数量，同时增加M2型TAMs的数量[21]。我们之前的研究表明，E. coli感染与免疫抑制性细胞因子（IL-10和TGF-β）的上调以及髓系来源的抑制细胞（MDSCs）和PD-L1阳性细胞的显著增加有关[22]。总体而言，这些因素表明肿瘤内细菌重塑了TME，加剧了免疫抑制并加速了肿瘤进展。尽管抗生素疗法可以抑制肿瘤内细菌[23]，但全身给药有可能破坏肠道微生物群并诱导多重耐药性。

作为抗生素的替代品，噬菌体是一类普遍存在的细菌病毒，其在管理细菌感染方面具有多个优势，包括高特异性、良好的生物安全性和相对易于大规模生产[24],[25]。噬菌体的严格宿主特异性确保了其卓越的生物安全性[26],[27]。根据它们与宿主的相互作用，噬菌体被分为烈性噬菌体和温和噬菌体。烈性噬菌体利用宿主细菌作为“工厂”在细菌中繁殖以诱导裂解[28]。在之前的工作中，我们分离出了溶瘤E. coli噬菌体（YZ2），它是Tequatrovirus属的成员。YZ2特异性地感染并在E. coli内复制，提供了固有的靶向精度[29]。此外，常用于基因工程中的M13噬菌体[30],[31]具有圆柱形形态，长度约为0.8 ～ 0.9 μm，直径约为6 ～ 7 nm。它由单链DNA基因组和五种衣壳蛋白（pIII、pVI、pVII、pIX和pVIII）组成。pIII蛋白常用于通过噬菌体展示技术展示外源肽。Seneca Valley病毒（SVV）是一种溶瘤病毒，其3C蛋白在溶瘤过程中起着关键作用。在之前的工作中，我们通过将其基因组中整合两个关键功能基因——精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）和3C，成功构建了一种工程化的M13噬菌体（eM13）。eM13展示了一种RGD肽，该肽能够结合肿瘤细胞上过表达的αvβ₃整合素受体，显著提高了靶向精度。此外，eM13能够在真核细胞中表达溶瘤3C基因，导致肿瘤细胞裂解。这些特性使eM13成为一种有吸引力的新型溶瘤病毒候选者，用于靶向癌症治疗[32]。

在我们之前的研究中，我们通过引入一个重原子碘对Cy7进行化学修饰，得到了碘化氰化物衍生物CyI，它在照射下显示出清除肿瘤内细菌的有效性[22]。然而，CyI溶解度较差，缺乏对肿瘤内细菌的精确靶向和识别能力。在本研究中，为了增强抗菌效果，我们通过酰胺化将E. coli特异性噬菌体YZ2与光敏剂CyI结合，生成了YZ2-CyI（YC）。接下来，通过在交联剂原儿茶醛铁（PA@Fe）的存在下共孵育YC和工程化的eM13噬菌体，形成了杂合细菌噬菌体水凝胶（YC-eM13 gel），该交联剂介导了动态席夫碱键的形成（图1）。在肿瘤内给药后，YC-eM13凝胶中的pH敏感配位键（catechol?Fe）和动态席夫碱键在TME中断裂，释放出eM13和YC。eM13通过表达3C蛋白促进溶瘤作用，该蛋白介导抗肿瘤效应。YC特异性地靶向肿瘤内细菌并通过抗菌光疗效果将其清除。这些细菌的靶向清除逆转了免疫抑制，增强了溶瘤免疫疗法的疗效。通过同时缓解免疫抑制并在TME内增强免疫激活，这种基于杂合细菌噬菌体的水凝胶为代表一种治疗晚期和复发性转移性乳腺癌的有希望的治疗方法。

章节摘录

YC-eM13凝胶的制备和表征

我们构建了一种重组噬菌体，称为eM13，其在表面展示了RGD肽，并在其基因组中插入了真核表达盒和溶瘤3C序列，从而生成了一种能够特异性靶向肿瘤细胞的溶瘤噬菌体。透射电子显微镜（TEM）图像显示eM13具有大约1050 nm长的丝状结构（图2a）。将3C基序和靶向肽引入基因组

讨论

OVs通过裂解肿瘤细胞来触发抗肿瘤免疫，从而释放DAMPs和TAAs。然而，这种免疫反应的疗效通常受到ITME的限制。最近在微生物测序和空间转录组学方面的进展发现了固体肿瘤内的肿瘤内细菌。与其他恶性肿瘤相比，乳腺癌中的微生物丰度和多样性特别高。先前的研究表明E. coli加剧了乳腺癌的ITME

结论

材料

NIR染料CyI（MW 776.5）是在我们的实验室制备的。NaCl购自中国上海的Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd。PEG8000、四环素、无水三氯化铁和原儿茶醛购自中国上海的Macklin Biochemical Co., Ltd。2×Mix购自Vazyme Biotech Co., Ltd。3C基因的上游和下游引物购自中国上海的Sangon Biotech Co., Ltd。SOSG购自大连美仑生物技术有限公司

CRediT作者贡献声明

陈刚：撰写 – 审稿与编辑、项目管理、资金筹集、概念构思。张希超：数据管理。吕白：撰写 – 初稿、方法学、调查、正式分析、数据管理。王伟杰：调查、正式分析。刘婷婷：方法学。钟申杰：方法学。徐玲：数据管理。金峰：数据管理。曹杰：撰写 – 审稿与编辑、资金筹集、概念构思。徐月华：撰写 – 审稿与编辑，

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致谢

本工作得到了国家自然科学基金（批准号：31900993、32171362）、山东省青年泰山学者计划（批准号：tsqn202507257、tsqn202306168）、山东省自然科学基金（批准号：ZR2023MH352、ZR2022YQ73）以及山东省高校青年创新科技计划（批准号：2024KJJ039）的支持。

吕白|张希超|刘婷婷|王伟杰|徐玲|钟申杰|金峰|徐月华|曹杰|陈刚

中国青岛市健康与康复科学大学生命科学与健康学院神经肿瘤学创新整合医学山东省重点医学与健康实验室，中国青岛市266042