人源多能干细胞衍生的工程化肌肉组织经增强成熟后可用于鉴定临床相关rAAV产品

《STAR Protocols》：Engineered muscle tissues with enhanced maturation enable the identification of clinically relevant rAAV products

　　

开发能够重现天然人体组织结构与功能的体外模型，对于理解病理生理机制及提升临床前研究可靠性至关重要。研究人员证明，源自人多能干细胞（hPSC）的工程化肌肉组织（EMT）可作为基因治疗的体外平台。源自腺相关病毒（AAV）的重组载体以高效率、剂量依赖方式转导EMT，可在人细胞背景下长期评估转基因表达。研究人员利用该模型对8种天然AAV衣壳进行比对分析，发现其相对效率取决于EMT成熟水平；在施加单轴机械牵张的更成熟组织中，AAV9表现更优，表明分化条件对转导过程具有重要影响。该模型同时证实了专为改善肌肉转导而设计的人工MyoAAV变体具有更高效率。综上，本工作凸显了人源EMT在评估AAV介导转基因表达及其对肌肉表型功能影响中的潜力。

研究背景与立项依据

神经肌肉疾病（NMD）基因治疗临床前开发依赖动物模型，但种属差异导致临床转化效力低于预期，且全身给药rAAV可引发补体激活相关血栓性微血管病、肾损伤、心肌损伤及肌炎等严重不良事件，抗AAV免疫呈剂量依赖。现有人诱导多能干细胞（iPSC）二维肌管模型成熟度高不足。研究人员旨在构建基于hPSC与组织工程的人源EMT临床前测试平台，以弥补动物实验与二维培养局限。该研究发表于《STAR Protocols》姊妹刊体系下的Molecular Therapy: Methods & Clinical Development（OMTA）。

主要关键技术方法

研究人员采用健康成人男性尿源iPSC（UC3-4系），经无血清、无外源转基因定向分化为肌源性祖细胞，荧光激活细胞分选ErbB3⁺阳性群体；将细胞包埋于Matrigel-纤维蛋白水凝胶双柱之间生成EMT；自主设计MyoStretch装置施加15%单轴恒张力机械牵张，提升细胞密度至2.0×10⁶细胞/组织以促进成熟；以Spc5-12启动子驱动分泌型小鼠碱性磷酸酶（mSEAP）为报告基因，将rAAV载体于成胶时掺入水凝胶；通过发光法动态检测上清mSEAP、RT-qPCR定量转录本、共聚焦免疫荧光（α-actinin、肌动蛋白）评估形态、电刺激测收缩力与钙依赖性，系统比较8种天然血清型（AAV1/2/3b/5/6/8/9/10）及5种人工肌向衣壳（AAVMYO、MyoAAV-1C/1E/2A/2E）。

研究结果

添加rAAV载体于iPSC衍生EMT中实现高效转基因转导

研究人员将rAAV6-Spc5.12-mSEAP于水凝胶成型时加入，分化培养基切换优于增殖培养基，载体包埋优于培养基添加；最低有效剂量为1.0×10³ vg/细胞，第4天即可检出，10天达平台并稳定至32天；1.0×10⁵ vg/细胞峰值后下降，提示高剂量饱和或毒性。

iPSC衍生EMT中衣壳比对凸显成熟不足

标准EMT中AAV6、AAV2、AAV1最高，AAV8/AAV9比AAV6低10–100倍，重现二维培养而非体内肌肉特征，证实标准EMT成熟受限。

提高细胞密度与机械牵张改善EMT成熟

优化条件（2.0×10⁶细胞、15%牵张）使肌管沿牵张轴对齐比例由30%升至44%，收缩振幅中位比为289%，无外钙/1 mM钙力比由0.19升至0.47，成人型MYH1表达显著上调，胚胎/胎儿型MYH3/MYH8下调，显示成熟推进。

衣壳比对结果依赖于EMT成熟度

成熟EMT中AAV9、AAV5受益最大（AAV9优化增益最高），AAV1/2/6受牵张条件抑制；五种肌向衣壳均优于或等同AAV9，MyoAAV-1E第10天活性为AAV9的14倍，AAVMYO增益最显著但绝对值未超AAV9；证明成熟水平改变衣壳排序，成熟EMT可预判体内优势血清型。

讨论与结论翻译

本研究证明hPSC衍生生物工程肌肉组织可作为rAAV肌肉基因治疗疗效评估的临床前平台，未来可补充动物实验。标准EMT可稳定监测转基因表达超1个月，剂量依赖明确；高倍数感染复数（MOI）后期活性衰减或源于细胞毒性及基因组处理饱和。MyoStretch单轴牵张促进iPSC-EMT成熟，表现为肌管对齐、MYH1表达、收缩力及钙内储依赖增强。8天然+5人工衣壳筛查显示，成熟EMT能重演体内已知趋势（AAV9及MyoAAV变体占优），与原代肌管初筛排序一致；该平台较原代细胞更具扩展性，较二维培养更适长期功能评估。结论：iPSC衍生EMT具肌肉基因治疗临床前潜力，提升组织成熟度是下一代理AAV药物发现管线部署该模型的核心前提。