通过细胞内纳米电池将吞噬细胞转化为活体免疫放大器，以增强肿瘤免疫疗法的效果

《Biomaterials》：Transforming Adoptive Macrophages into Living Immune Amplifiers with Intracellular Nanobatteries to Potentiate Tumor Immunotherapy

　　

摘要

adoptive macrophage疗法在实体瘤免疫治疗中具有巨大潜力，但往往受到表型持久性差以及无法重塑广泛的免疫抑制性肿瘤微环境（TME）的制约。在此，我们报告了一种名为Charged Macrophage (ChAR-M)的纳米电池驱动的活性免疫放大器，它能够持续激活巨噬细胞并重塑TME的免疫环境。ChAR-M是通过将一种由Toll样受体7/8激动剂R848的氧化还原响应二聚体组成的细胞内纳米电池安装到巨噬细胞中而生成的。这种纳米电池持续向细胞内释放免疫刺激信号，维持M1样巨噬细胞的极化状态，并防止肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）的重新编程。除了细胞自主激活外，ChAR-M还作为一种活性的免疫放大器，通过持续分泌促炎细胞因子和生物活性细胞外囊泡将抗肿瘤信号传递给周围的TAMs。这种旁分泌放大作用重新建立了巨噬细胞之间的通信网络，推动了免疫抑制性TME的级联重塑。因此，ChAR-M将免疫抑制性肿瘤转化为免疫激活性微环境，其特征是T细胞浸润增强、调节性T细胞积累减少、血管生成受到抑制以及转移进程受到抑制。在乳腺癌和黑色素瘤小鼠模型中，ChAR-M引发了强烈的抗肿瘤反应，并显著抑制了肿瘤进展。这项工作确立了细胞内纳米电池作为编程活性免疫放大器的一般策略，为持久重塑肿瘤免疫微环境提供了非基因手段。

引言

实体瘤会建立一个高度免疫抑制性的肿瘤微环境（TIME），这极大地限制了癌症免疫治疗的效果 [1]、[2]、[3]、[4]、[5]。在TIME中的多种细胞成分中，肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）是最丰富的免疫细胞群体之一，它们在肿瘤进展中起着核心调节作用 [6]、[7]、[8]、[9]。TAMs主要表现出M2样表型，其特征是分泌抑制性细胞因子，这些细胞因子会抑制细胞毒性T细胞的活性并促进肿瘤进展 [10]、[11]。因此，高水平的TAMs浸润与不良预后和治疗抵抗性密切相关，这突显了巨噬细胞作为重塑TIME的关键靶点 [12]、[13]、[14]。由于巨噬细胞具有显著的塑性和天然的肿瘤趋向性，它们已成为基于细胞的免疫治疗的有希望的候选者。与基于淋巴细胞的策略 [15]、[16] 相比，巨噬细胞具有独特的优势，包括能够有效渗透到密集的肿瘤基质中、强大的吞噬能力，以及整合先天性和适应性免疫信号的能力 [17]、[18]、[19]、[20]。这些特点推动了基于巨噬细胞的治疗平台的发展，包括嵌合抗原受体巨噬细胞（CAR-M）[17]、[19]、[21]、[22]、装载药物的巨噬细胞 [18]、[23] 以及工程化的巨噬细胞递送系统 [20]、[23]、[24]。尽管在临床前研究中取得了令人鼓舞的进展，但采用巨噬细胞疗法的临床转化仍受到几个根本性挑战的制约。

一个核心障碍是工程化巨噬细胞在肿瘤微环境（TME）中的表型稳定性较差。虽然巨噬细胞可以在体外被极化为抗肿瘤的M1样状态，但它们很容易受到肿瘤衍生信号的影响而迅速重新编程，并且在肿瘤浸润后通常会恢复到免疫抑制性的M2样表型 [18]、[19]。这种表型可塑性严重影响了治疗的持久性。此外，大多数现有策略主要集中在增强输注巨噬细胞自身的功能上，而忽视了它们调节主导肿瘤免疫的更广泛的TAMs的能力 [17]、[21]、[25]。因此，治疗效果仅限于被给予的细胞，无法在丰富的内源性巨噬细胞群体中扩散，从而未能充分重塑TME。

为了解决这些限制，理想的基于巨噬细胞的免疫疗法不仅应保留转移细胞的抗肿瘤表型，还应能够在整个内源性巨噬细胞网络中放大和传播免疫激活。细胞-材料混合工程的最新进展表明，能够持续释放生物活性信号的细胞内生物材料可以作为有效的免疫细胞命运和功能调节器 [24]、[25]、[26]。受到这一概念的启发，我们设想通过为巨噬细胞配备一个能够在肿瘤浸润后持续提供刺激的细胞内自维持系统，将它们转化为“活性的免疫放大器”。

在这里，我们报道了一种基于在巨噬细胞内安装自组装纳米电池的Charged Macrophage (ChAR-M)策略。这种纳米电池由一种氧化还原响应的R848二聚体（RssR）构成，其中两个Toll样受体7/8（TLR7/8）激动剂R848分子通过二硫键连接 [27]、[28]、[29]。由于RssR的两亲性，它可以自发组装成纳米颗粒，这些纳米颗粒可以被巨噬细胞有效内化。一旦进入还原性的细胞内环境，纳米电池就会逐渐解体（见图1），从而持续释放R848并提供连续的免疫刺激信号 [29]、[30]、[31]。与主要作为被动载体的传统装载药物的巨噬细胞不同，ChAR-M通过细胞内和旁分泌机制主动重塑TME。持续的细胞内激活即使在免疫抑制条件下也能保持M1样表型。更重要的是，ChAR-M作为一种活性的免疫放大器，通过细胞因子分泌和细胞外囊泡介导的旁分泌调节，将刺激信号传递给周围的TAMs，从而诱导M2样TAMs的二次重新编程。这启动了一个巨噬细胞重塑的级联过程，将局部激活扩展为对TME的全面重构。如图1所示，静脉注射的ChAR-M通过巨噬细胞的固有肿瘤定向能力在肿瘤中积累。 infiltration后，细胞内纳米电池持续驱动巨噬细胞激活，抵抗肿瘤引起的重新编程，并促进内源性TAMs的广泛重塑。这种巨噬细胞重塑增强了抗原呈现，促进了T细胞浸润，抑制了血管生成和转移，最终产生了强烈的抗肿瘤免疫。通过将细胞内纳米电池工程与活的免疫细胞结合，这项工作建立了一种非基因性的、可扩展的巨噬细胞工程策略，将治疗性巨噬细胞从孤立的效果器转化为系统性的免疫放大器，以持久重塑实体瘤的TME。

章节片段

RssR纳米电池的制备和表征

RssR前体药物是通过将两个R848分子通过二硫键（NHS-PEG1-SS-PEG1-NHS）连接起来合成的，形成可逆的酰胺键（图1A）。RssR前体药物中的二硫键可以通过内溶酶体微环境中的γ-干扰素诱导的溶酶体硫醇还原酶（GILT）等还原性因子切割 [32]、[33]、[34]，随后酰胺键发生环状断裂，从而实现R848的无痕释放。通过

结论

在这项研究中，我们开发了一种纳米电池驱动的巨噬细胞疗法，称为Charged Macrophage (ChAR-M)，以克服基于巨噬细胞的实体瘤免疫治疗的局限性。通过安装一个可持续的基于R848的细胞内纳米电池，ChAR-M提供了持续的TLR7/8刺激，实现了长期维持M1样表型、抵抗TAMs的重新编程，并与周围巨噬细胞进行功能交流。与传统工程化巨噬细胞不同

材料和试剂

Reiquimod（R848）和DiOC3购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州）。NHS-PEG1-SS-PEG1-NHS购自Bide Pharmatech Ltd（中国）。Milli-Q水（18.2 MΩ cm）使用Millipore水纯化系统（美国马萨诸塞州比勒里卡）生产。Transcriptor试剂盒购自Beyotime（美国）。所有用于定量聚合酶链反应（qPCR）的引物均来自Sangon Biotech（中国上海）。一抗和二抗来源于Cell

CRediT作者贡献声明

Haijing Qu：写作 – 审稿与编辑，撰写原始草稿，验证，方法学，研究，资金获取，正式分析，数据管理，概念化。Qingping Wu：可视化，验证，方法学，研究。Yuqing Pan：可视化，验证，方法学，研究。Jie Wu：可视化，验证，方法学。Han Chen：可视化，验证，方法学。Wei Meng：可视化，验证，方法学。Ning Wang：可视化，验证，

利益冲突声明

? 作者声明以下可能的利益冲突/个人关系：Xiangdong Xue持有待授权的上海交通大学的专利。其他作者声明他们没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本工作得到了中国国家自然科学基金（编号32571603、82172084）、上海自然科学基金（25ZR1402237）、上海交通大学创业基金（25X010506036）和STI2030重大项目（2022ZD0212500）的财政支持。方案由Biorender.com设计。

Haijing Qu|Yuqing Pan|Qingping Wu|Jie Wu|Han Chen|Ning Wang|Wei Meng|Zejian Wang|Xiangdong Xue

上海交通大学药理科学学院，上海前沿药物靶点识别与递送科学中心，上海抗体-药物偶联创新靶点国家重点实验室，上海200240，中国