具有结核病相关病理生理学意义的邻苯二甲酰亚胺衍生物的合成、多靶点酶抑制及计算机模拟评估

《Bioorganic Chemistry》：Synthesis, multi-target enzyme inhibition, and in silico evaluation of phthalimide derivatives with relevance to tuberculosis-associated pathophysiology

　　

摘要 由结核分枝杆菌（Mtb）引起的结核病仍然是全球健康的重要隐患，需要创新的治疗方案。尿素酶是 Mtb 中参与氮获取和吞噬体碱化的细菌酶，而胸苷磷酸化酶（TP）、黄嘌呤氧化酶（XO）和丁酰胆碱酯酶（BChE）分别是与核苷酸代谢、氧化应激以及胆碱能/免疫调节相关的宿主酶，纳入本研究旨在探索与结核病相关病理生理学潜在相关的酶抑制谱。在本研究中，合成了一系列新的邻苯二甲酰亚胺衍生物，并通过 1H NMR 和 13C NMR 进行结构表征，并在 DFT 水平（B3LYP/6-31G）上进行了进一步优化。酶抑制实验表明，这些化合物对四个靶点均显示出抑制活性。化合物 C15 被证明是最有效的多靶点酶抑制剂，对尿素酶（IC?? = 2.90 ± 0.11 μM）、XO（IC?? = 5.61 ± 0.14 μM）和 BChE（IC?? = 9.49 ± 0.18 μM）表现出强活性，而化合物 C17 对 TP 显示出最大的效力（IC?? = 3.24 ± 0.28 μM）。进行了紫外 - 可见分光光度分析以检查酶 - 配体相互作用，揭示了与复合物形成一致的浓度依赖性变化。在该系列化合物中，C17 对 TP 和尿素酶表现出最强的结合亲和力，而 C15 对 XO 显示出最强的亲和力。构效关系分析鉴定出苯并噻唑、卤素、硝基、磺酰胺和羧酸官能团是酶抑制活性的重要贡献因素。总的来说，这些发现确定了 C15 和 C17 为有前景的先导化合物，可进一步优化作为多靶点酶抑制剂。

引言 结核病（TB）由病原体结核分枝杆菌（Mtb）引起，仍然是全球传染病死亡的主要原因之一 [1]。根据世界卫生组织 2024 年全球结核病报告，2023 年结核病导致约 125 万人死亡，并再次成为全球头号传染病杀手 [2]。耐多药结核病（MDR-TB）和广泛耐药结核病（XDR-TB）菌株的不断出现，严重削弱了现有抗结核疗法的有效性，突显了对新型治疗策略的迫切需求。由于对单靶点药物的耐药性通常通过补偿性基因突变产生，当代药物发现工作越来越强调开发能够同时破坏细菌生存和持久性所需多个生物途径的多靶点药物 [3]。Mtb 是一种需氧病原体，严重依赖氧化磷酸化和可适应的代谢网络来产生能量并维持细胞内生存。尿素酶是该病原体 Mtb 中的一种潜在代谢途径，因为它在营养有限的条件下对氮获取很重要 [4]。Lin 等人表明，Mtb 的尿素酶敲除突变体无法利用尿素作为氮源，导致与野生型相比生长受损。还发现由尿素酶作用从尿素产生的氨作为细菌代谢的主要氮源。尽管尿素酶基因的敲除突变对巨噬细胞和小鼠中的细菌活力没有显著影响，但尿素酶有助于吞噬体碱化，最重要的是，有助于 Mtb 的代谢多样性 [5]。Mtb 在宿主内的生存依赖于其在压力时期利用各种营养源的能力；在长期感染期间，尿素酶抑制可被视为对细菌适应能力和生存能力有害。因此，尿素酶仍被认为是开发抗结核杆菌新药的有前景候选物 [6]。氧化还原酶代表了一类涉及电子转移反应的主要酶，调节细菌生长、氧化还原稳态和毒力。这些酶利用黄素单核苷酸（FMN）、黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP+）等辅因子来促进基本代谢过程 [7]。几种氧化还原酶，包括 NADH 脱氢酶-II（NDH-II）、脱甲基戊烯基磷酸 -β-D-核糖 2′-氧化酶（DprE1）、泛醇 - 细胞色素 c 还原酶（QcrB）和硫氧还蛋白还原酶（TrxR），已成为抗结核药物开发的有前景靶点。在氧化还原酶中，黄素依赖性单加氧酶因其参与抗生素耐药机制而引起了极大关注。这些酶使用黄素辅因子催化氧转移反应，并使结构多样的抗生素失活 [8], [9]。据报道，几种细菌单加氧酶能降解四环素、利福霉素、利福平衍生物和磺胺类药物，从而促成抗菌耐药性的发展。因此，抑制这些酶代表了一种恢复抗生素效力和克服耐药性结核感染的有前景策略 [10]。尽管 BChE 不是 Mtb 的主要酶靶点，但越来越多的文献表明，胆碱能系统参与结核病感染中免疫反应的调节。在感染和炎症过程中，包括结核病，观察到血清中胆碱酯酶活性的变化，其中活性降低是疾病严重程度和营养不良状态的指标 [11]。正如在阿尔茨海默病中，胆碱酯酶抑制剂因具有疾病修饰而非治愈作用而受到重视一样，TB 中的 BChE 最好被视为消除病原体的手段，而是作为与疾病严重程度和治疗反应相关的宿主炎症和营养状态的切入点 [12]。除了能量代谢外，核苷酸生物合成途径对于 Mtb 的生存和复制同样关键。嘧啶作为核酸和许多细胞代谢物不可或缺的构建模块，使其生物合成和补救途径成为有吸引力的治疗靶点 [13]。Mtb 拥有嘧啶生产的从头合成和补救途径，允许病原体适应潜伏感染期间如肉芽肿病变等营养受限的环境 [14]。补救途径在营养剥夺条件下特别重要，因为它通过回收预先存在的核酸成分来节约细胞能量 [15]。TP 是嘧啶补救途径中的关键酶，催化胸苷可逆磷酸解为胸腺嘧啶和脱氧核糖 -1- 磷酸。通过参与 DNA 合成、修复和核酸回收，TP 在细菌增殖和生存中发挥关键作用，使其成为抗菌干预的有吸引力靶点 [16]。然而，成功清除体内的致病病原体后，结核病治疗方案通常伴随许多副作用和并发症，目前可用的仅有一个治疗靶点的抗结核药物并未考虑到这些，因此需要开发双靶点药物候选物。胸苷磷酸化酶提供了基于结核病后肺部疾病导致的组织结构变化的另一种解释 [17]，因为胸苷磷酸化酶不仅是嘧啶补救酶，还是血管生成和促纤维化介质，因为其酶促作用产生的产物通过活性氧诱导的 NF-κB 激活以及促血管生成和重塑基因（如 IL-8、IL-6 和纤维连接蛋白 -1）的表达来诱导血管生成 [18]；这种机制在功能上与成功完成结核病治疗的人肺中发生的血管化、空洞化和纤维化瘢痕相似；因此，一种同时作用于病原体及该酶的分子将有助于解决这一问题。最后，还有一个机制性和分析性的原因，因为由肝脏生物合成的酶丁酰胆碱酯酶调节胆碱能抗炎途径，但其血清水平在肝脏急性或慢性炎症、损伤、感染、损伤和营养不良期间降低 [19]；具体而言，这种减少与炎症程度相关，并在炎症消退后恢复正常 [20]，从而提供了一种植机制，通过这种机制，该酶可能有助于导致结核病中干酪样变和纤维化的巨噬细胞持续炎症，同时也提供了一种低成本的监测导致抗结核治疗中断的肝毒性的方法。涉及抗结核药物副作用的一个靶点是黄嘌呤氧化酶。这种副作用是由吡嗪酰胺的代谢物吡嗪酸被黄嘌呤氧化酶氧化为 5- 羟基吡嗪酸引起的，这导致体内尿酸积累，引起高尿酸血症、关节痛和急性痛风性关节炎，因为酶的催化循环不仅同时产生活性氧，还产生尿酸，从而导致组织水平的氧化损伤；因此，一种设计为在其抗结核药效团内具有内在和受控的黄嘌呤氧化酶抑制潜力的分子，将能够预防这种毒性，而不是需要在现有复杂治疗方案中额外增加一种降尿酸药物 [21], [22]。总之，这三种酶在药物介导的高尿酸毒性、血管生成/纤维化病理以及炎症/肝功能不全中的参与，为在设计抗结核药物时采用多靶点方法提供了合乎逻辑的理由。N- 取代邻苯二甲酰亚胺衍生物（基于异吲哚啉 -1,3- 二酮核心）已成为针对多个途径同时进行药物开发的有吸引力候选物 [23]。该骨架提供了几项关键优势：结构刚性、来自吸电子亚胺基团的可调电子特性，以及在 N- 位进行化学修饰的卓越灵活性。这些特征使化合物能够在酶活性位点内形成多种非共价相互作用 - 包括氢键、芳香相互作用和疏水接触。此外，它们有利的理化性质使邻苯二甲酰亚胺特别适合开发针对病原体细菌基本代谢途径的抑制剂。邻苯二甲酰亚胺骨架结合了两种有益的电子特性：缺电子亚胺核心与芳香共轭配对。这种组合在亲脂性和亲水性之间创造了最佳平衡（优化的 LogP），同时减少了氢键供体的数量。这些性质增强了化合物被动穿过细胞膜的能力并提高了口服生物利用度 [24], [25]。邻苯二甲酰亚胺的结构模块化允许在 N- 位引入多种官能团，便于系统地研究构效关系。基于邻苯二甲酰亚胺的化合物已显示出多样化的治疗潜力，包括抗增殖、免疫调节、神经保护、驱虫、镇痛和抗分枝杆菌作用，突出了它们作为复杂疾病环境中多用途抑制剂的价值 [26]。因此，合成并评估了一组新的邻苯二甲酰亚胺衍生物库，针对四种选定的酶，代表与结核病相关病理生理学相关的细菌和宿主相关生化过程：以尿素酶作为细菌酶靶点，以及 TP、XO 和 BChE 作为宿主酶。采用分子对接来表征结合模式并识别关键氢键、π- 堆积和疏水相互作用，而构效关系（SAR）分析用于检查效力和选择性的结构决定因素。因此，目前的工作旨在建立多靶点酶抑制谱和计算支持的结合假说，而不是证明直接的抗分枝杆菌效力。

章节片段
合成设计与化合物合成
邻苯二甲酸酐（a）与一系列结构不同的伯胺（b）在甲醇溶剂体系（包括乙酸）中处理（方案 1）。合成通过形成通用的邻苯甲酰酸中间体而发生，这是伯胺对邻苯二甲酸酐亲核加成的结果。加热反应混合物 12 小时后，产生所需的邻苯甲酰酸中间体。进一步加热 24 小时导致形成

邻苯二甲酰亚胺库的合成与光谱表征
通过邻苯二甲酸酐与结构多样的取代胺在乙酸存在下缩合，合成了一组 21 个邻苯二甲酰亚胺衍生物（1C–21C）。化合物 1C–12C 的结构表征通过互补光谱技术（1H NMR、13C NMR 和质谱）完成；这些衍生物已在我们的早期研究中报道 [27]。化合物 13C–21C 代表在本研究中制备的新衍生物。

结论
合成并评估了一系列邻苯二甲酰亚胺衍生物对尿素酶、TP、XO 和 BChE 的抑制作用，得到了分子对接、紫外 - 可见分光光度法和 SAR 分析的支持。化合物 C15 显示出最强的整体多靶点酶抑制谱，对尿素酶、XO 和 BChE 具有强抑制作用，而 C17 对 TP 显示出最大的效力，并对 TP 和尿素酶表现出最强的结合亲和力。对接分析确定了氢键、疏水接触、

数据可用性与软件
本研究中使用的所有软件包和计算工具均可通过其官方网站或存储库公开获取。用于分子对接、分子动力学模拟、可视化和结构分析的程序作为开源资源或在学术许可下提供，确保计算工作流程的透明度和可重复性。所有数据均包含在主稿件和补充信息中。

CRediT 作者贡献声明
Aneela Khushal：撰写 – 初稿，软件，方法论，形式分析，数据整理，概念化。Sara Khan：撰写 – 审阅与编辑，撰写 – 初稿，项目管理，方法论，调查，形式分析，概念化。Umar Farooq：撰写 – 审阅与编辑，监督，调查，概念化。Muhammad Naseem Khan：撰写 – 审阅与编辑，可视化，方法论，形式分析。

米斯巴·哈菲兹：资源、方法论、形式分析未引用的参考文献 [37]、[38]
利益冲突声明
作者声明，他们没有任何已知的竞争性经济利益或个人关系可能会影响本文中报告的工作。
致谢
作者向伊斯兰堡科姆萨茨大学阿博塔巴德校区化学系表示感谢，感谢其提供的实验室设施和研究支持。
阿妮拉·库沙尔|萨拉·汗|乌马尔·法鲁克|穆罕默德·纳西姆·汗|米斯巴·哈菲兹|丽兹万娜·萨瓦尔
伊斯兰堡科姆萨茨大学阿博塔巴德校区化学系，巴基斯坦开伯尔-普什图省