《Bioorganic Chemistry》：Screening of diphenylterephthalamide derivatives against
Mycobacterium tuberculosis: an
in silico and
in vitro study
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摘要
β-碳酸酐酶（CanB）已被验证为开发抗结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）新型抗结核化合物的潜在靶点。该酶在维持胞内pH稳态、细菌存活及致病性中发挥关键作用，使其成为新型抗结核治疗中极具前景且可成药的靶点。目前已鉴定出
摘要
β-碳酸酐酶（CanB）已被验证为开发抗结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）新型抗结核化合物的潜在靶点。该酶在维持胞内pH稳态、细菌存活及致病性中发挥关键作用，使其成为新型抗结核治疗中极具前景且可成药的靶点。目前已鉴定出多种抑制剂，包括磺胺类（sulfonamides）、二硫代氨基甲酸酯类（dithiocarbamates）、羧酸类（carboxylic acids）、酚类化合物（phenolic compounds）及双苯基对苯二甲酰胺衍生物（diphenylterephthalamide derivatives）。
在本研究中，研究人员采用计算机模拟（in silico）技术与体外生物学评价相结合的方法，进一步开发属于N,N′-双苯基对苯二甲酰胺类别的CanB抑制剂。为此，研究人员应用结构相似性方法对National Cancer Institute数据库进行挖掘，以优先筛选可获取的化合物。生物学评价表明，其中12种化合物表现出强效抗分枝杆菌活性，MIC值范围为0.125至2 μg/mL。此外，选定的化合物能够有效抑制CanB，将其酯酶活性降低至35%以下，并显示出对该酶的高亲和力（Kd介于0.12至3.10 μM之间），这一结果通过热位移实验（thermal shift assay）得到证实。总体而言，本研究明确表明双苯基对苯二甲酰胺骨架代表了开发具有抗分枝杆菌特性的CanB抑制剂的有效工具。
论文解读文章
一、研究背景与问题
结核病（tuberculosis, TB）仍是最具挑战性的全球公共卫生问题之一。结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, Mtb）作为结核病的致病菌，其耐药菌株的持续蔓延，尤其是耐多药（multidrug-resistant, MDR）和广泛耐药（extensively drug-resistant, XDR）菌株的出现，对现有的抗结核治疗方案构成了严峻威胁。因此，开发具有新作用机制的抗结核药物迫在眉睫。
β-碳酸酐酶（β-carbonic anhydrase, CanB）由Mtb基因组中的rv3588c基因编码，是Mtb三种β-碳酸酐酶（CanA、CanB、CanC）中功能最为核心的一种。CanB催化二氧化碳的可逆水合反应，生成碳酸氢根离子，该离子是Mtb多种代谢和生物合成途径所必需的底物，包括脂肪酸和分枝菌酸的生物合成、嘌呤/嘧啶及氨基酸的合成，以及补充克雷布斯循环中间体的回补反应。此外，CanB在维持胞内pH稳态和代谢稳态中发挥作用，有助于细菌在应激条件下的持续存活。鉴于CanB与人类碳酸酐酶在结构上的显著差异，且CanB已被证实是Mtb在标准条件下生长所必需的酶，它被视为一个有前景且可成药的抗结核药物靶点。
在本研究团队的前期工作中，已通过条件性基因敲低突变体证实CanB对Mtb体外存活至关重要，并通过虚拟筛选从National Cancer Institute（NCI）数据库中鉴定出一小批双苯甲酰胺衍生物，作为CanB的推定变构抑制剂，能够结合于二聚体-二聚体界面并阻止酶活性四聚体形式的组装。初步构效关系（structure-activity relationship, SAR）研究表明，单烷基化修饰的胍基末端部分有利于提高活性（MIC范围为0.3至5.0 μg/mL）。进一步的结构优化显示，将胍基末端部分进行二烷基化（如化合物I）、延长为2-氨基-2-亚氨基乙基部分（如化合物II）或引入胍基取代基（如化合物III），均为发现新型CanB抑制剂提供了有价值的替代方案。
二、研究内容与结论
基于上述背景，本研究的目的是通过结构相似性搜索策略，进一步拓展双苯基对苯二甲酰胺类CanB抑制剂的化学空间和构效关系。研究人员以三种亲本化合物I、II和III为模板，通过Enhanced NCI Database Browser对NCI数据库（含超过250,000种化合物）进行相似性搜索，基于SMILES符号并设定Tanimoto指数大于90%的阈值，优先获取了32种结构相近的化合物组成小型化合物库。研究人员对这些化合物进行了系统的抗分枝杆菌活性评价和CanB酯酶抑制活性测定，并通过分子对接模拟和热位移实验（thermal shift assay）探讨了作用机制和亲和力。
研究结果表明，16种化合物表现出显著的Mtb生长抑制活性（MIC ≤5 μg/mL），其中12种显示出强效活性（MIC ≤2 μg/mL）。在这些化合物中，10种能够抑制CanB酯酶活性25%-80%，其中4种（化合物6、10、11和12）能将残余酶活性降低至35%以下。进一步的浓度依赖性实验表明，这4种化合物的IC50值范围为0.19至0.27 mM，与阳性对照乙酰唑胺（acetazolamide, ACZ）相当。热位移实验证实这些化合物对CanB具有高亲和力，解离常数（dissociation constant, Kd）介于0.12至3.10 μM之间。其中化合物6表现出最佳的综合性能：MIC值为0.5 μg/mL，酯酶抑制率达65%，Kd值为0.12 μM。
构效关系分析揭示了以下关键规律：末端胍基部分的单烷基化（如化合物1、2）保持良好活性；将胍基部分环化形成五元含氮杂环（如化合物6）可维持甚至增强活性；碳二亚胺基部分连接直链烷基（如化合物10-12）可提高酯酶抑制活性；而支链烷基、六元环或杂环替代则通常降低活性。此外，分子对接模拟表明，化合物末端的含氮氢键供体基团与CanB二聚体-二聚体界面的关键氨基酸残基（Glu173、Glu88和Asn111）形成盐桥和氢键相互作用，分子的准平面构象和线性排列是实现最优相互作用的重要几何约束。对苯二甲酰胺核心的对位取代模式和末端苯环的对位取代模式对活性至关重要，任何改变为间位取代都会导致活性大幅丧失。
三、主要技术方法
本研究采用的主要技术方法包括：（1）基于结构相似性原理的数据库挖掘方法，利用Enhanced NCI Database Browser对NCI化合物数据库进行相似性搜索；（2）分子对接模拟，使用Schr?dinger套件中的Glide软件（Standard Precision协议）将化合物对接至CanB二聚体-二聚体界面的假定位点；（3）微量稀释法测定最低抑菌浓度（MIC90），采用刃天青微孔板测定法（resazurin microtiter assay, REMA）评估化合物对Mtb H37Rv标准株的药物敏感性；（4）CanB酯酶活性抑制实验，以吲哚乙酸酯为底物测定化合物的酶抑制活性；（5）差示扫描荧光法（differential scanning fluorimetry, DSF）热位移实验，利用Tycho NT.6仪器测定蛋白质内在色氨酸和酪氨酸荧光，计算化合物的解离常数（Kd）。Mtb培养实验在BLS3安全实验室中进行。
四、结果与讨论
（一）基于相似性的双苯基对苯二甲酰胺骨架亚类化合物设计与抗分枝杆菌活性评价
通过对NCI数据库进行相似性搜索获得32种化合物后，研究人员评估了这些化合物的抗分枝杆菌活性和CanB酯酶抑制活性。结果鉴定出12种具有强效抗Mtb活性的化合物（MIC ≤2 μg/mL），其中4种化合物（6和10-12）能有效抑制CanB酯酶活性。构效关系分析表明，末端胍基和碳亚胺基部分以小烷基取代基修饰或嵌入五元含氮杂环中，是赋予N,N-双苯基对苯二甲酰胺骨架亚微摩尔级抗Mtb活性的有利化学特征。分子对接模拟表明，两个分子边缘的含氮氢键供体是与CanB二聚体-二聚体界面氨基酸发生关键相互作用所必需的，分子的线性排列和末端取代苯基的准平面构象是额外的重要几何约束。
（二）CanB作为双苯基对苯二甲酰胺骨架潜在靶点的生化验证
化合物6和10-12因兼具最佳的抗分枝杆菌活性（MIC范围为0.5至2.0 μg/mL）和酯酶抑制活性（超过65%）而被选作进一步研究。浓度依赖性实验证实这些化合物以剂量依赖性方式抑制CanB酯酶活性，IC50值范围为0.19至0.27 mM。热位移实验表明，在10 μM浓度下，所有化合物均能引起CanB变性曲线的显著右移（0.5至2.5°C），表明化合物与酶发生结合并导致结构稳定化。通过单一位点配体结合方程计算Kd值，证实这些化合物是CanB的强效结合剂，表现出低微摩尔至亚微摩尔级的Kd值（0.12至3.10 μM）。
五、讨论与结论
讨论部分指出，酯酶活性仅部分反映CanB的生理性碳酸酐酶（水合酶）活性，但两种反应由同一活性位点催化。研究人员强调，与已知的强效水合酶活性抑制剂（如乙酰唑胺，其水合酶抑制活性在纳摩尔范围）仅在较高浓度下对酯酶活性有效（高微摩尔范围）的观察一致，本研究中测得的IC50值与ACZ相当，符合预期。热位移实验进一步从物理结合层面确认了化合物与CanB的直接相互作用。
本研究进一步验证了N,N′-双苯基对苯二甲酰胺作为开发具有强效抗分枝杆菌活性的CanB抑制剂的具有前景的骨架。构效关系分析确定了与生物学功效相关的关键结构决定因素，强调了骨架几何构型和取代模式对靶点抑制的重要性。虽然这些分子被设计为结合CanB的二聚体-二聚体界面，预期能选择性靶向分枝杆菌酶而不抑制人类碳酸酐酶，但仍需进一步研究加以证实。目前正在进行进一步的临床前研究，以评估最有前景的候选化合物作为新型结核病治疗药物的药理学特性和治疗潜力。
