经过蛋白酶保护处理的PRG4自扩增RNA脂质纳米颗粒可恢复骨关节炎患者的软骨稳态

《Biomaterials》：Protease-shielded PRG4 self-amplifying RNA lipid nanoparticles restore cartilage homeostasis in osteoarthritis

　　

摘要

骨关节炎（OA）是一种衰弱的关节疾病，其特征是边界润滑逐渐丧失和软骨稳态被打乱。蛋白聚糖4（PRG4）是一种关键的边界润滑剂，但在OA中，由于局部表达减少、关节内的清除以及炎症关节微环境中的蛋白酶介导的加工，PRG4的功能可能会受到影响。在这里，我们发现人类和小鼠的OA软骨中PRG4均存在下调现象，并开发了一种多功能脂质纳米颗粒（LNP）平台——sa/A@E LNPs（PRG4 saRNA/AEBSF@EC12 LNPs），以实现持续的润滑和软骨保护。在该系统中，PRG4 saRNA通过含有新型可电离脂质EC12的LNP递送，同时搭配广谱丝氨酸蛋白酶抑制剂AEBSF。AEBSF旨在保护内源性和saRNA表达的PRG4免受OA微环境中丰富的蛋白酶的攻击，而EC12不仅作为递送成分，还作为NRF2信号通路的内在激活剂。机制上，EC12结合KEAP1，促进NRF2向细胞核的转位，并增加NRF2的稳定性，从而激活内源性抗氧化反应。sa/A@E LNPs能够深入软骨层。在一种内侧半月板（DMM）损伤的小鼠模型中，关节内注射sa/A@E LNPs可减轻软骨侵蚀并改善关节功能。这些发现共同建立了一种多功能治疗策略，整合了润滑恢复、广谱丝氨酸蛋白酶防护和抗氧化激活作用，为将sa/A@E LNPs作为OA治疗的有望的调节平台提供了支持。

引言

骨关节炎（OA）是慢性疼痛和功能下降的主要原因，导致长期的身体残疾[1]。全球约有5亿人受到OA的影响，且患病率持续上升[2]。因此，与OA管理相关的个人和社会医疗成本巨大且不断增长。尽管经济负担日益加重，目前的OA药物主要侧重于缓解症状[3]。现有的药物治疗方法，包括非甾体抗炎药和关节内皮质类固醇，主要提供症状缓解，并不能逆转关节结构退化[4],[5]。

蛋白聚糖4（PRG4），也称为润滑素，是一种主要由滑膜细胞和表层软骨细胞分泌的糖蛋白，它通过提供边界润滑和调节炎症信号来维持关节稳态[6],[7],[8]。PRG4是一种大分子、高度糖基化的黏蛋白样蛋白质，其原生表层蛋白的分子量约为345 kDa[9]。PRG4的缺失与OA的进展有关，小鼠中的PRG4缺乏会导致软骨退化和关节形态异常[8],[10]。与这些观察结果一致，外源性PRG4补充剂在多个临床前模型中延缓了OA的进展[8],[11],[12],[13],[14],[15],[16]，表明PRG4/润滑素蛋白疗法是一种经过验证且具有生物活性的基于PRG4的策略。除了局部表达减少和关节内清除外，PRG4/润滑素可能在炎症关节微环境中受到蛋白酶的降解。早期的生化研究表明，酶解会损害人类润滑素的边界润滑功能[17]。据报道，肥大细胞相关のトリプターゼβ也能切割PRG4并降低其润滑功能，但它应被视为众多PRG4切割蛋白酶之一，而非唯一或主要的介质[18]。重要的是，OA相关的蛋白降解可能是多酶参与的。组织蛋白酶G能降解重组人类PRG4和来自人类滑液的天然润滑素，包括糖基化和非糖基化区域[19]。中性粒细胞弹性蛋白酶的活性也与关节损伤和炎症性关节炎后的软骨退化及滑液边界润滑能力丧失有关[20]。因此，基于PRG4的干预措施可能受益于维持局部PRG4可用性的策略，同时保护PRG4/润滑素免受广泛丝氨酸蛋白酶的降解。为此，我们引入了AEBSF作为广谱丝氨酸蛋白酶防护成分，以保护内源性和saRNA表达的PRG4在富含蛋白酶的OA微环境中的稳定性。

通过脂质纳米颗粒（LNPs）递送的自扩增RNA（saRNA）提供了一个有吸引力的解决方案[21],[22]。与重组蛋白疗法相比，saRNA能够在相对较低的剂量下实现治疗蛋白的长期局部产生，而LNPs则无需进入细胞核即可实现高效的内细胞递送[23],[24]。这些特性使saRNA-LNPs特别适合用于关节内基因递送。基于此，我们设计了一种多功能PRG4 saRNA纳米平台，其中包含AEBSF作为广谱丝氨酸蛋白酶防护成分。为了进一步提高治疗效果，我们通过用尿素键替换ALC-0315中的酯键，开发了一种具有生物活性的可电离脂质EC12。除了支持saRNA的包封和递送外，EC12还设计用于参与KEAP1-NRF2信号通路，从而增强内源性抗氧化防御[25],[26],[27]。这一特性尤为重要，因为氧化应激是OA中软骨细胞功能障碍、炎症放大和基质破坏的核心驱动因素。

在这项研究中，我们测试了以下假设：持续的PRG4产生、广谱丝氨酸蛋白酶防护和抗氧化调节可以共同作用，以恢复OA中的软骨稳态。这一框架不依赖トリプターゼβ作为唯一的PRG4降解酶；相反，它认识到PRG4的功能可能受到多种因素的影响，包括局部表达减少、关节内清除以及トリプターゼβ、组织蛋白酶G、中性粒细胞弹性蛋白酶和其他OA相关蛋白酶的降解。因此，我们设计了含有AEBSF的LNPs作为广谱丝氨酸蛋白酶防护策略。这种多功能纳米平台在DMM模型中表现出长期的关节内保留、深入软骨层的能力以及强大的软骨保护效果。总的来说，我们的发现建立了一种同时针对OA中的润滑失败、蛋白酶降解和氧化应激的治疗策略。

部分摘录

PRG4下调与骨关节炎进展相关

PRG4是滑膜关节中的关键边界润滑剂，有助于在机械负荷时耗散应变能量[28]。先前的研究表明，PRG4赋予滑液能量耗散特性，并且重组PRG4在大鼠OA模型中具有软骨保护作用[8],[29]。此外，关节内过度表达Prg4已被报道可以防止小鼠发生创伤后OA[30]。为了进一步明确其临床和分子相关性

讨论

PRG4/润滑素主要由表层软骨细胞和滑膜纤维母细胞/滑膜细胞产生，位于软骨表面润滑和滑液稳态的交界处。在我们的研究中，PRG4在稳态软骨细胞群体中富集，在炎症/分解代谢性软骨细胞群体中减少，且在受损的人类OA软骨和DMM小鼠软骨中PRG4蛋白含量降低。因此，PRG4 saRNA/AEBSF@EC12 LNPs的治疗效果是

结论

总体而言，我们的研究建立了一种互补的多功能PRG4基治疗策略，用于OA治疗，该策略在单一平台上结合了编码的局部PRG4产生、蛋白酶保护和抗氧化通路激活。与现有的PRG4/润滑素蛋白补充方法不同，PRG4 saRNA/AEBSF@EC12 LNPs可能有助于在富含蛋白酶和氧化环境的OA中维持PRG4的可用性并支持PRG4的修复过程。通过整合润滑

小鼠

本研究获得了四川大学华西医院伦理委员会的批准，伦理注册号为20240527004（小鼠）。10周龄的雄性C57BL/6小鼠被饲养在无特定病原体的条件下，适应期为1周，温度为22° ± 2°C，光照/黑暗周期为12小时，食物和水可自由获取。通过DMM建立了膝关节OA模型。操作步骤如下：小鼠在全身麻醉下进行麻醉，然后进行正中切口

CRediT作者贡献声明

Yupei Zhang：方法学、调查、数据分析、概念化。Chaoyi Zhang：监督、软件、项目管理、方法学、调查。Yaojia Zhou：验证、监督、软件、方法学、数据分析。Yuting Chen：写作-审稿与编辑、验证、监督、方法学。Jinwei Xie：资源、项目管理、调查、资金获取。Shugang Qin：验证、监督。Guang Xie：方法学、数据分析。

数据可用性

支持本研究所有发现的数据均包含在论文及其补充信息中。如需更多数据，可联系论文联系人。

利益冲突

作者声明没有已知的利益冲突。部分示意图是用BioRender.com创建的。

利益冲突声明

? 作者声明没有已知的可能影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

我们感谢所有共享公共数据库的研究人员以及为本研究提供样本的所有患者。本工作得到了国家自然科学基金（NSFC）对ZYH（82472491; 92049101; 81972097）的资助。此外，本研究还得到了国家重点研发计划（2022YFC2505500）、四川省科技计划对ZYH（2025YFHZ0202）、JWX（2023YFS0233）以及华西医院“启明星”研究基金的支持

Zhao Zhang|Yupei Zhang|Chaoyi Zhang|Yaojia Zhou|Shugang Qin|Guang Xie|Yuting Chen|Jinwei Xie|Xiangrong Song|Zeyu Huang

中华人民共和国四川省成都市四川大学华西医院骨科研究所骨科外科