《Fishes》：Dietary Astaxanthin Improves Growth, Modulates Skin Antioxidants and Transcriptomics in Koi Carp (Cyprinus carpio) Under Acute Cold Stress
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冷应激会破坏观赏性锦鲤（*Cyprinus carpio*）的氧化还原稳态和皮肤结构完整性。为探究虾青素（AX）长期效应的不明确问题，本研究检测了90天膳食补充对冷休克及恢复期间生长性能和皮肤源性抗氧化机制的影响。研究人员将锦鲤分为5组，分别饲喂含0 mg
冷应激会破坏观赏性锦鲤（*Cyprinus carpio*）的氧化还原稳态和皮肤结构完整性。为探究虾青素（AX）长期效应的不明确问题，本研究检测了90天膳食补充对冷休克及恢复期间生长性能和皮肤源性抗氧化机制的影响。研究人员将锦鲤分为5组，分别饲喂含0 mg/kg（AX0）、25 mg/kg（AX25）、50 mg/kg（AX50）、75 mg/kg（AX75）和100 mg/kg（AX100）虾青素的饲料90天，随后测定生长性能；在将实验鱼急性转移至13 °C环境后评估其皮肤抗氧化能力；分别在膳食AX干预90天后、冷应激暴露后及恢复期后采集皮肤样本，测定丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、蛋白羰基和谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）水平。研究人员对AX0和AX75组在冷应激暴露后及恢复期后的样本进行了转录组学分析和蛋白质-蛋白质关联网络分析。AX75处理组表现出最佳的生长性能。在冷应激条件下，AX0组表现出较高的MDA水平和较低的SOD活性，而AX75组则表现为较低的MDA水平和较高的SOD活性。在恢复期，与AX0组相比，AX75组CAT活性和GSH水平升高，同时MDA和蛋白羰基水平维持在较低水平。转录组学分析揭示了与磷酸戊糖途径和氧化还原代谢相关的候选基因存在与膳食处理相关的差异表达。综上，本研究表明，75 mg/kg虾青素可促进生长，产生最强的抗冷应激抗氧化响应，并有助于应激后的恢复。
## 论文解读
### 一、研究背景与研究意义
锦鲤（*Cyprinus carpio*）作为具有重要商业价值的观赏鱼类，其体表美学价值和健康状况备受关注。鱼类皮肤作为分隔体内生理环境与外界水环境的初级保护屏障，持续暴露于外部环境波动之中。除结构支撑和黏膜防御功能外，皮肤还是代谢活跃的组织，极易受到环境扰动的损害，尤其是温度的急剧下降。环境水温的骤降可诱发急性冷休克，破坏代谢稳态和生理平衡。快速降温会改变细胞膜流动性、离子转运、线粒体功能和能量代谢，进而诱导活性氧（ROS）的过量产生，超出内源性抗氧化防御系统的清除能力。若氧化应激得不到有效控制，将导致脂质过氧化、蛋白质氧化、组织结构损伤及免疫功能抑制。鱼类依赖超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）等酶促抗氧化防御体系，以及还原型谷胱甘肽（GSH）等非酶促清除剂来恢复细胞氧化还原平衡。
虾青素（AX）是一种强效酮式类胡萝卜素，凭借其优异的自由基清除和抗氧化能力，被广泛用作水产养殖中的功能性饲料添加剂。其独特的分子结构包含共轭双键和极性末端环，可跨膜锚定于细胞膜中，有效淬灭ROS、终止脂质过氧化级联反应并维护膜结构完整性。此外，虾青素还能调控Keap1/Nrf2信号轴及磷酸戊糖途径（PPP）等关键胞内抗氧化通路，为还原性生物合成和GSH再生提供NADPH。尽管已有大量研究探讨了虾青素在水生动物中的应用，但研究重点主要集中在着色、免疫性能、肠道健康及一般应激方面，关于虾青素在冷应激期间特异性作用的信息仍然有限。此外，现有涉及冷应激和虾青素补充的研究涉及不同鱼类物种，难以得出标准化结论。因此，本研究旨在评估长期膳食虾青素补充是否促进锦鲤生长并对皮肤抗氧化体系产生预适应效应，从而减轻冷休克损伤并加速应激后皮肤组织恢复。
### 二、主要技术方法
研究采用450尾健康锦鲤（初始体重5.05 ± 0.8 g），购自中国上海海洋大学滨海研究站，适应实验室条件14天后随机分为5个膳食处理组（每组90尾鱼，每组设3个重复300 L水槽，每槽30尾）。设计5种等氮饲料，分别添加0（对照组AX0）、25（AX25）、50（AX50）、75（AX75）和100（AX100）mg/kg的人工合成虾青素（Sigma-Aldrich公司），采用双螺杆挤出机造粒。实验分两个阶段：第一阶段为90天喂养试验，每日3次投喂至表观饱食；第二阶段为温度应激实验，将水温在1小时内从28 °C降至13 °C并维持12小时（冷应激期），随后恢复至28 ± 1 °C并持续24小时（恢复期）。研究人员运用硫代巴比妥酸反应物法测定MDA、DTNB法测定GSH、监测H?O?分解测定CAT活性、肾上腺素自氧化抑制法测定SOD、DNPH法测定蛋白羰基含量、监测NADPH氧化测定GPX活性，并采用ELISA试剂盒检测皮肤虾青素含量。转录组分析选用AX0和AX75组在冷应激期和恢复期的皮肤样本，经RNA提取、cDNA文库构建后利用Illumina NovaSeq X Plus平台进行150 bp双端测序，比对到锦鲤参考基因组（GCF_000951615.1），使用DESeq2鉴定差异表达基因，并利用STRING数据库构建蛋白质-蛋白质关联网络。
### 三、研究结果
**3.1 不同虾青素水平对锦鲤生长性能的影响**
90天喂养实验显示，随着膳食虾青素水平从AX0增加至AX75，末体重（FBW）、增重（WG）、特定生长率（SGR）和平均日增重（ADG）均呈上升趋势，而AX100组则出现下降。其中AX75组的FBW、WG、SGR和ADG显著高于其他处理组。所有处理组均保持100%存活率，未观察到明显死亡率差异。
**3.2 抗氧化酶活性**
**3.2.1 90天膳食处理后的氧化变化**
90天膳食虾青素补充以剂量依赖方式显著调节皮肤抗氧化参数和氧化应激标志物。与AX0对照组相比，各AX补充组的SOD活性显著升高；AX25、AX75和AX100组蛋白羰基含量显著降低；GPX活性在AX50组达到最低水平；GSH含量呈渐进性升高趋势，在AX75组达到最大值并显著高于所有其他膳食组；AX75组CAT活性显著高于AX0组；所有AX补充组的MDA浓度均较AX0组显著降低。
**3.2.2 冷应激相关的氧化变化及存活率**
暴露于13 °C后，各处理组均出现明显氧化变化。与AX0组相比，所有AX补充组的SOD和GSH活性显著升高，蛋白羰基水平显著降低。AX25、AX50和AX100组的GPX活性显著低于AX0组。AX75组CAT活性显著高于AX0组。所有AX补充组的MDA浓度均较AX0组显著降低。冷应激后，AX75组的存活率显著高于其他处理组。
**3.2.3 恢复期相关的氧化变化**
恢复期后，膳食AX预处理对皮肤氧化动态仍持续发挥显著影响。AX75组的SOD、GPX和CAT活性显著高于AX0组。AX50、AX75和AX100组的蛋白羰基含量显著低于AX0和AX25组。与AX0组相比，所有AX补充组的GSH水平显著升高，MDA水平显著降低。
**3.3 皮肤虾青素含量**
在三个评估时间点（90天、冷应激期、恢复期），皮肤虾青素浓度从AX0至AX75呈逐步上升趋势，在AX100组出现回落。90天后和冷应激后，AX75组皮肤虾青素水平均显著高于其他所有组，AX0组则最低。恢复期期间，AX75组皮肤虾青素含量仍显著高于其他处理组。
**3.4 转录组响应**
主成分分析（PCA）显示AX0和AX75膳食组在两个实验阶段均呈现清晰分离。冷应激期PC1解释总方差的76.04%，恢复期PC1解释51.04%，表明膳食补充是皮肤样本转录组变异的主要来源。四维韦恩图分析共鉴定出各处理组间的独有基因和重叠基因。火山图显示AX75组与AX0组在冷应激和恢复期均存在大量显著上调和下调基因。功能注释突出鉴定了与氧化还原代谢和系统稳态相关的关键候选基因，包括转酮醇酶样蛋白1（TKTL1）和阴离子交换器溶质载体家族4成员1（SLC4A1）的显著差异表达。
**3.5 蛋白质-蛋白质关联网络分析**
STRING蛋白质-蛋白质关联网络分析在冷应激阶段（AX0CS vs. AX75CS）揭示了以应激反应、蛋白质稳态和免疫相关节点为中心的关键相互作用，明确显示了hsp90aa1.1、hsp70.3、xbp1和tlr2之间的直接功能连接，以及timp2b与mmp2、mmp13与mtdh等亚网络互作。恢复阶段（AX0RV vs. AX75RV）网络转向氧化还原和谷胱甘肽代谢相关蛋白，形成由sirt1、gclc、gpx1b、sod2和hmox1a组成的高度互联簇，其中gclc作为核心枢纽节点直接连接gpx1b、sod2、hmox1a和sirt1。KEGG富集分析显示冷应激期差异通路包括神经活性配体-受体相互作用、赖氨酸降解和氧化磷酸化；恢复期最显著富集的通路为内质网蛋白质加工。
### 四、讨论与结论
本研究证实，长期膳食虾青素预处理能够有效增强皮肤酶促和非酶促抗氧化网络。其中75 mg/kg虾青素作用最为显著，可明显上调关键抗氧化酶（SOD和CAT）并补充非酶促储备（GSH），同时抑制生物分子损伤指标（MDA和蛋白羰基）在常温条件和冷应激挑战下的积累。其分子基础在于虾青素独特的亲脂-亲水双亲性分子结构，可跨膜定位以直接中和ROS，上调Nrf2介导的抗氧化基因转录，并在严重冷应激期间阻断脂质过氧化级联反应。在急性冷应激中，AX75处理有效减弱了冷诱导的氧化损伤；在恢复阶段，AX75组展现出更优的生化恢复轨迹，表现为GSH持续升高、MDA水平维持低位以及皮肤AX沉积。转录组学和STRING分析进一步揭示了应激反应和氧化还原相关关键节点的变化。
研究结论表明，90天膳食虾青素补充可促进锦鲤生长性能，有效缓解冷应激诱导的氧化应激，并维护皮肤氧化还原稳态。75 mg/kg虾青素预处理显著增强了皮肤酶促和非酶促防御网络，提高了SOD、CAT和GSH水平，同时在热应激及后续恢复阶段显著减弱MDA和蛋白羰基的积累。转录组分析进一步证实了这些生理改善，揭示了与磷酸戊糖途径和细胞氧化还原代谢密切相关的候选基因的膳食诱导调控。值得注意的是，将膳食剂量提高至100 mg/kg并未比75 mg/kg带来额外的生理或生化优势。综合而言，在本实验条件下，75 mg/kg膳食虾青素是所检测剂量中促进生长、增强皮肤组织结构、提高耐寒能力和加速生理恢复的最优添加水平，对水产养殖中锦鲤应对温度波动具有重要实践意义。
