集成甘油生物精炼： feast/famine运行下用于聚羟基脂肪酸酯生产的挥发酸平台

《Bioresource Technology》：Integrated glycerol biorefinery: volatile fatty acid platform for polyhydroxyalkanoates production under feast/famine operation

　　

聚羟基脂肪酸酯(PHA)是由多种微生物在胞内合成的一类生物基聚酯，其单体组成随环境条件和所用底物的不同而变化。PHA依据单体中碳原子数目分为短链PHA(SCL-PHA；3–5个碳原子)、中链PHA(MCL-PHA；6–14个碳原子)和长链PHA(LCL-PHA；>14个碳原子)。挥发性脂肪酸(VFA)因与PHA合成途径的代谢相似性而成为理想的PHA合成底物，其转化效率直接取决于VFA的种类、各酸的结构及工艺的能量需求。乙酸和丁酸通常转化为乙酰辅酶A，利于聚羟基丁酸酯(PHB)合成；丙酸和戊酸则转化为丙酰辅酶A，引导聚羟基戊酸酯(PHV)及共聚物的形成。厌氧发酵可将有机废物转化为具有广泛工业应用的VFA，该过程可通过特定微生物群落在可调节的操作条件下进行。甘油因其高生物降解性和相对简单的代谢途径而成为具有前景的生物技术应用底物；在厌氧条件下，甘油发酵可通过还原途径(生成1,3-丙二醇等还原产物)和氧化途径(生成有机酸)进行转化。氧化途径产生的VFA可在营养限制条件下作为PHA积累的易同化碳源，从而在两级生物转化过程中将甘油发酵与生物聚合物生产相连接。利用混合微生物菌群生产PHA可分为三个阶段：底物发酵(碳转化为VFA)、培养物筛选(富集PHA储存微生物)以及PHA生产(利用富含VFA的料液优化生产能力)。feast/famine制度是需氧系统中富集PHA生产微生物最广泛使用的策略之一，其基于序批式反应器(SBR)中运行的循环操作。底物的可利用性与营养不平衡(通常为氮和/或磷缺乏)相结合是富集PHA积累微生物的必要条件。甘油的增值利用(包括生物柴油生产中的粗甘油)有助于减少与处置相关的环境影响，并支持生物经济和循环经济战略；然而，粗甘油的實際应用需考虑其成分可变性以及残余甲醇、皂类、盐类、催化剂和游离脂肪酸的潜在抑制作用。尽管关于甘油生产PHA和产酸发酵生成VFA的文献已大量存在，但将这两个过程整合到单一生物平台的研究仍然稀少。以往研究主要涉及从粗甘油直接生产PHA，或侧重于富集策略和特定发酵产物的转化，而上游发酵条件与下游PHA操作的综合效应较少受到关注；特别是HRT对VFA组成的影响及其对PHA合成的后续影响尚未被系统探索。在此背景下，本研究通过两级方法评估甘油增值转化，将HRT驱动的VFA谱变化与序批式反应器中不同的进料策略联系起来，重点考察厌氧和好氧进料在引导碳流向PHA积累中的作用，以增进对混合培养生物精炼系统中碳回收的理解。

**论文解读：集成甘油生物精炼中VFA平台与 feast/famine 运行策略对PHA合成的影响**

**1. 研究背景**

聚羟基脂肪酸酯(PHA)是一类由微生物胞内合成的生物基聚酯，具有生物可降解性、生物相容性、紫外线抗性及热塑性能等优势，被视为传统合成塑料的可持续替代品。PHA依据单体碳原子数分为短链PHA(SCL-PHA；3–5碳)、中链PHA(MCL-PHA；6–14碳)和长链PHA(LCL-PHA；>14碳)。挥发性脂肪酸(VFA)因其代谢相似性而被认为是PHA合成的理想底物，其中乙酸和丁酸倾向于生成聚羟基丁酸酯(PHB)，丙酸和戊酸则引导聚羟基戊酸酯(PHV)和共聚物的形成。厌氧发酵可将有机废弃物转化为富含VFA的料流，而甘油作为一种高生物降解性和代谢途径相对简单的底物，可通过氧化途径产生有机酸，进而为PHA积累提供易同化碳源。

然而，既往研究多集中于从粗甘油直接生产PHA或对特定发酵产物进行富集转化，将甘油酸发酵与下游PHA生产整合至单一生物平台的研究仍然匮乏。尤其是水力停留时间(HRT)对VFA组成谱的调控作用及其对后续PHA合成的级联影响尚未得到系统探讨。本研究旨在填补这一空白，通过两级生物转化工艺将甘油酸发酵与PHA积累相耦合，考察不同HRT条件下VFA谱变化与序批式反应器(SBR)中不同进料策略的交互效应，以深化对混合培养生物精炼系统中碳回收机制的理解。

**2. 主要技术方法**

研究人员采用实验室规模的两级连续流反应系统开展研究。上游为工作体积3.2L的半连续产酸反应器(AR)，在30±1°C中温条件下运行，以纯甘油配制的10g COD/L有机负荷为底物，分别施加4天和8天两种HRT，连续运行210天。接种污泥取自巴西Itapissuma某啤酒废水处理厂的中温厌氧污泥。下游为工作体积2.0L的序批式反应器(SBR)，以AR发酵 effluent 为碳源(经0.45μm膜过滤并稀释至2.5g COD/L)，运行187天，每循环6小时。SBR接种污泥取自巴西Recife某污水处理厂曝气塘的好氧污泥。实验分两个阶段：阶段1为好氧进料—好氧反应(107天)，阶段2为厌氧进料—厌氧反应(80天)，两阶段均通过循环结构施加 feast/famine 选择压。分析手段包括气相色谱-火焰离子化检测(GC-FID)定量VFA、高效液相色谱(HPLC)测定甘油及代谢产物、离子色谱分析磷酸盐、气相色谱-热导检测器(GC-TCD)分析沼气组成。PHA定量采用甲醇解-氯仿萃取法结合GC-FID检测，以聚(3-羟基丁酸-co-3-羟基戊酸酯)(PHBVH)为校准标准。

**3. 研究结果**

**3.1 接种物与甘油溶液的初始表征**

甘油溶液pH接近中性(7.0–7.2)，可减少AR中pH冲击，有利于产酸发酵。进水可溶性COD占比(SCOD/COD)约0.93–0.98，表明甘油具有高生物可利用性。进水COD/TKN比相对较高，提示相对于有机负荷存在氮限制，这一条件有利于 feast/famine 条件下混合菌群将碳流向胞内储存物质。不同HRT阶段进料组成的相似性确保观察到的差异主要归因于运行条件而非底物变化。

**3.2 发酵行为与VFA谱**

在HRT为4天期间，系统呈现明显波动状态，总VFA最大浓度达2630 mgCOD/L(第55天)，以丁酸为主(占总VFA的68%)，属于丁酸型发酵途径。该途径在严格厌氧条件下通过热力学有利的乙酰辅酶A缩合反应实现NAD⁺再生，维持胞内氧化还原平衡。将HRT延长至8天后，总VFA产量提高约21%，最大值接近3170 mgCOD/L，且代谢谱向链延伸方向转变：己酸(1050 mgCOD/L)和丁酸(1220 mgCOD/L)成为主要产物，丙酸、乙酸和戊酸浓度分别达895、485和286 mgCOD/L。HRT 8天条件下丁酸、己酸与丙酸合计约占VFA的79%，表明氧化途径与链延伸途径共同作用，有助于NADH/NAD⁺比率的平衡。在产率方面，HRT 4天和8天的最大VFA产率分别为263和317 mgCOD/gCOD，体积产率则分别为0.66和0.40 gCOD/L·d，表明较短HRT利于提高体积产率，较长HRT促进底物向VFA的转化效率。COD质量平衡分析显示，HRT 4天时碳主要流向VFA(0.96g/d)，而HRT 8天时沼气产量上升至0.98g/d，以CO₂和CH₄为主，表明长HRT促进产甲烷进程。

**3.3 PHA富集培养反应器的稳定性**

SBR运行前30天经历驯化期，洗出了生长缓慢及沉降性能差的微生物。驯化后生物量从590增至850 mgSSV/L，第69天达峰值935 mgSSV/L。第75天后生物量下降48%至480 mgSSV/L，显微镜检查发现线虫类多细胞生物，判定其为导致固体浓度骤降的捕食性微生物，故此阶段2需重新接种(3630 mg/L)。阶段2经过约8周过渡期后，生物量稳定在820±71 mgSSV/L(约5周)，表明系统达到稳定运行状态。

**3.4 生物聚合物生产循环与产率分析**

阶段1(好氧进料)代表性循环中，进料阶段溶解氧(DO)从5.97降至3.94 mg/L，随后回升至7.3 mg/L，feast/famine(F/F)比值为0.03，低于文献推荐的PHA富集适宜范围(<0.25)。循环中丙酸初始浓度最高(约28 mgCOD/L)，进料前10分钟内丙酸、丁酸、乙酸分别减少了81%、57%和40%。PHB浓度在循环前2小时内从约6升至7.5 mg/L，随后在饥饿期降至6 mg/L，表明积累聚合物被微生物利用。丁酸因可直接生成3-羟基丁酸(3HB)单位，其同化速率高于需两分子乙酰辅酶A缩合的乙酸。PHH浓度较低(<2 mg/L)且波动小，与戊酸和己酸等中链前体物浓度低(<10 mg/L)一致。磷酸盐浓度在整个 feast 期呈现下降趋势，未观察到聚磷酸盐水解释放磷酸盐的现象，表明PHA储存代谢与典型聚磷酸盐积累生物(PAO)代谢解偶联。

阶段2(厌氧进料)的F/F比值为0.09，虽然高于阶段1但仍低于文献报道的类似系统稳态值(0.2)。VFA谱显著不同：己酸为主导酸(起始约120 mgCOD/L)，乙酸、丙酸和丁酸初始浓度较低(分别为10、25和35 mgCOD/L)。在厌氧反应阶段，观察到各VFA浓度同步上升，表明SBR内存在发酵活性。好氧反应开始后VFA浓度逐渐下降，但残留MCCA(己酸)在循环结束时仍然存在，符合文献中MCCA较SCCA更难生物降解的报道。PHB浓度在厌氧进料阶段快速增加，120分钟内达约10 mg/L并趋于稳定；PHH仅运行末期检测到约2 mg/L。磷酸盐浓度呈现先下降20–25%、厌氧阶段上升约40%的变化模式，与强化生物除磷(EBPR)系统中聚磷酸盐水解释放磷酸盐的特征一致。值得关注的是，HRT延长后产生的MCCA增加并未引起PHA积累量或组成多样性的相应提高，提示更长链的MCCA虽具有理论上的能量优势，但被本研究中的混合菌群同化的代谢可及性可能较低。

**3.5 体积产率与碳向PHA的转化效率**

阶段1中PHB体积产率在循环初期达到峰值35.76 mgPHB/L·h，随后骤降至0.81–0.89 mgPHB/L·h，饥饿期降至负值(?1.36 mgPHB/L·h)，表明外源碳受限时聚合物被动员利用。PHH产率始终较低(初始最大4.13 mgPHH/L·h)。阶段2中PHB产率初始峰值更高，达58.83 mgPHB/L·h，随后趋于零或负值。在 feast 阶段，阶段2显示出更高的PHA积累效率(7.98 mg/L)和更高的平均体积产率(59.77 mgPHA/L·h)，120分钟后总PHA维持在7.33 mg/L。产率系数方面，阶段2 feast 阶段的YPHA/VFA为0.37 gPHA/gVFA，高于阶段1的0.28 gPHA/gVFA；YPHA/GLY在阶段2达到0.64 gPHA/g甘油，显著高于阶段1的0.20 gPHA/g甘油。该 YPHA/GLY 值高于近期文献中利用甘油为碳源报道的0.33–0.34 gPHB/g甘油的产率水平，表明将甘油酸发酵与厌氧 feast–好氧 famine 制度相耦合可增强碳向PHA的回收效率。

**4. 结论**

将产酸甘油发酵与下游聚羟基脂肪酸酯积累相结合的研究表明，碳回收效率取决于发酵产物的组成和序批式反应器的运行策略。将HRT从4天延长至8天使VFA产量提高21%(达3167 mgCOD/L)，减少了残余甘油，并使发酵产物谱向富含丁酸和己酸的方向转变。然而，这些中链羧酸浓度的增加并未带来PHA积累量的相应提升，说明VFA浓度并非决定下游聚合物产率的唯一因素。在厌氧进料条件下，碳转化得到增强，体积产率达59.77 mgPHA/L·h，比产率为0.37 gPHA/gVFA和0.64 gPHA/g甘油；相比之下，好氧进料条件下的产率分别为0.28 g/g和0.20 g/g。上述结果阐明了HRT调控的VFA生产与下游聚合物合成之间的关系。因此，将上游发酵参数与下游进料策略相匹配，为在集成生物精炼框架中提升甘油来源碳的增值转化提供了一条可行路径。该研究发表于《Bioresource Technology》。