一种针对特定位点标记的分裂纳米Luc生物传感器，可用于快速、均匀地检测3-苯氧基苯甲酸

《Biosensors and Bioelectronics》：A Site-Specifically Labeled Split-NanoLuc Biosensor for Rapid Homogeneous Detection of 3-Phenoxybenzoic Acid

　　

摘要

用于均匀小分子检测的分裂NanoLuc生物传感器通常受到随机结合导致的结构异质性的限制，这会损害酶的互补效率和分析重复性。在这里，我们开发了一种位点特异性标记的分裂NanoLuc生物传感器，用于快速检测3-苯氧基苯甲酸（3-PBA），这是一种典型的拟除虫菊酯类杀虫剂暴露的生物标志物。我们采用了一种位点特异性的化学酶标记策略，结合了Sortase A介导的连接反应和基于肟的生物正交化学方法，生成了结构均匀的LgBiT-3-PBA探针。该传感器与SmBiT纳米体识别探针结合使用，能够在竞争性检测格式中实现高效的NanoLuc互补反应。通过结构优化，我们获得了超过28的信噪比，半数抑制浓度（IC₅₀）为2.3 ng/mL，检测限为0.41 ng/mL，整个检测过程仅需10分钟，且无需洗涤步骤。这与之前报道的3-PBA均匀检测方法相比，灵敏度提高了大约七倍。该传感器在尿液和水样中表现出令人满意的回收率，并且与超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）的结果高度吻合（R² = 0.98）。这项工作建立了一种位点特异性结合策略，用于构建均匀、高性能的分裂NanoLuc生物传感器，具有更广泛的小分子检测应用潜力。

引言

快速且灵敏地检测小分子（包括环境污染物、食品污染物和治疗药物）对于环境监测、食品安全和临床诊断至关重要（Chen等人，2024年）。基于仪器的分析方法，如气相色谱（GC）和高效液相色谱（HPLC），由于其高精度和可靠性而被广泛认为是金标准（Wahab等人，2022年）。然而，这些方法依赖于复杂的仪器、耗时的样品预处理以及熟练的操作人员，限制了它们在现场和高通量筛选中的应用（Li等人，2025年）。利用抗体-抗原识别的免疫测定法提供了另一种有吸引力的小分子检测方法，因为它们具有高灵敏度、低成本和所需的样品预处理很少。然而，传统的异质性格式仍然存在操作限制。酶联免疫吸附测定（ELISAs）通常需要多次孵化和洗涤步骤，导致检测时间延长和操作复杂（Zhao等人，2021年），而侧向流动免疫测定（LFIAs）往往定量精度不足且高通量能力有限（Thenuwara等人，2025年）。

均匀免疫测定法无需分离步骤，仅需“混合读取”即可实现检测，结合了快速分析、高通量和定量能力，提供了一个有前景的解决方案（Xu等人，2022年）。典型的小分子检测均匀方法包括荧光极化免疫测定（FPIA）（Choi等人，2015年；Li等人，2016年；Nishiyama等人，2021年）、荧光共振能量转移（FRET）（Ahn等人，2023年；Lee等人，2024年；Wang等人，2026年）和生物发光共振能量转移（BRET）（Miyata等人，2023年；Weihs等人，2020年；Zhao等人，2026年）。然而，由于固有的物理限制，这些方法的信噪比往往不佳（Wang等人，2019年）。FPIA和FRET依赖于外部光激发，因此容易受到样品自荧光、光散射和光漂白的背景干扰（Rani等人，2023年）。尽管BRET规避了与激发相关的背景，但其分析性能仍受到光子输出较低和荧光素酶供体信号衰减的依赖性限制（Weihs等人，2021年）。此外，FRET和BRET都受距离和取向依赖的偶极-偶极能量转移的支配。供体发射和受体激发之间的光谱重叠可能导致信号串扰，而能量转移效率随着供体-受体间距的增加而急剧下降，并且对分子几何形状非常敏感（Shrestha等人，2015年）。这些严格的空间和光学限制共同限制了信号的幅度、动态范围和检测的稳健性。

近年来，NanoLuc荧光素酶因其极高的光子输出、优异的信号稳定性和紧凑的分子尺寸而成为分析应用中的强大生物发光报告分子（Hall等人，2012年）。为了扩展其生物传感用途，NanoLuc被设计成一个分裂酶系统，称为Split-NanoLuc，由一个大片段（LgBiT）和一个小肽片段（SmBiT）组成（Dixon等人，2016年）。这些片段单独存在时是不活跃的，但在分子识别事件引起的接近作用下迅速重新组装成有功能的荧光素酶，产生放大的生物发光信号。得益于高信噪比、快速响应动力学和免洗涤操作，基于Split-NanoLuc的传感器已成为均匀小分子检测的有希望的平台。最近的研究表明，它们已在检测多种污染物方面取得成功，包括伏马菌素B1（Alsulami等人，2021年）、2,4-二氯苯氧乙酸（Ding等人，2022年）、赭曲霉毒素A（Xie等人，2022年）和对硫磷（Liang等人，2025年）。尽管取得了这些进展，但在实际应用分裂NanoLuc生物传感器进行小分子检测时仍面临重大挑战，特别是在制备结构明确定义的探针方面。传统的探针构建通常依赖于基于赖氨酸的随机化学结合，将配体和NanoLuc SmBiT片段连接到蛋白质或载体骨架上，这会产生结构不均匀的产品，标签的化学计量和取向控制较差（Anderson等人，2019年；Chudasama等人，2016年；Wang等人，2018年）。这种结构变异性会损害酶的互补效率，降低分析重复性，最终限制传感器的性能。

为了克服这些限制，位点特异性结合已成为生物共轭化学中的一个强大策略。与传统随机标记不同，它能够在定义的位点精确地附着功能分子，确保结构均匀性和可控的取向（Beck等人，2017年）。在这些方法中，Sortase A介导的化学酶连接特别具有吸引力，因为它表现出稳健的性能。Sortase A能够识别C端的LPXTG基序，并在温和的水性条件下催化与寡甘氨酸底物的转肽反应（Pishesha等人，2018年）。Sortase介导的连接已被广泛用于抗体的位点特异性标记和其他蛋白质（Al-Amin等人，2022年；Ding等人，2021年；Li等人，2018年）。与酶促连接相结合，生物正交点击化学为精确的生物分子修饰提供了额外的灵活性。醛基和氨基氧基之间的肟连接尤其具有优势，因为其具有高化学选择性、快速动力学和生理兼容性，形成的键稳定且没有有毒副产物（Tang和Becker，2014年）。肟连接已广泛用于肽与小分子（Mez?等人，2011年）、寡核苷酸（Singh等人，2004年；Zatsepin等人，2022年）和蛋白质（Hwang等人，2007年；Shao等人，2005年）的偶联。酶促和生物正交连接策略共同提供了一个稳健的框架，用于构建具有可控结构的均匀蛋白质共轭物，从而提高了基于蛋白质的传感平台的可靠性和分析性能。

在这项研究中，我们开发了一种结合Sortase A介导的连接反应和基于肟的生物正交化学的位点特异性化学酶标记策略，用于构建用于快速均匀检测小分子的分裂NanoLuc生物传感器。作为概念验证目标，选择了3-PBA，这是一种主要的代谢物，也是广泛认可的拟除虫菊酯类杀虫剂暴露的生物标志物（Lehmler等人，2022年）。系统地优化了关键检测参数，包括连接片段长度、试剂浓度和缓冲条件。从灵敏度和特异性方面全面评估了传感器的分析性能。通过加标回收实验和盲样分析验证了其准确性和可靠性。

部分片段

试剂

3-PBA（99.0%）从Anpel-Trace（中国上海）购买。3-苯氧基苯甲醛（99.1%）从Solarbio（中国北京）购买。3-苯氧基苯甲醇（98.0%）从Acmec Biochemical（中国上海）购买。4-(3-羟基苯氧基)苯甲酸（99.0%）从Beyotime Biotechnology（中国上海）购买。溴氰菊酯（99.3%）、氰戊菊酯（98.5%）、氯氰菊酯（99.3%）、芬普罗帕特林（98.3%）和倍硫磷（98.3%）由上海农药公司提供。

位点特异性Split-NanoLuc生物传感器的设计

分裂NanoLuc生物传感器在检测小分子时的一个核心挑战是由于随机结合引入的结构异质性。传统的基于赖氨酸的化学标记通常会产生配体与蛋白质比例不明确且取向可变的混合物，这可能会损害酶的互补效率并导致分析重复性差。为了克服这一限制，我们建立了一种位点特异性的化学酶结合平台来生成结构

结论

在这项工作中，我们成功建立了一种结合Sortase A介导的连接反应和基于肟的生物正交化学的位点特异性化学酶结合策略。设计了一种双功能GGGK(ONH₂)支架，以满足3-PBA功能化的化学要求和Sortase A的寡甘氨酸底物要求，从而实现LgBiT-3-PBA探针的位点特异性构建。所得探针有效克服了常见的结构异质性

CRediT作者贡献声明

Xiude Hua：写作 – 审稿与编辑，监督，项目管理。 Kaiyuan Zheng：方法学，研究。 Yuan Ding：验证，数据管理。 Zekun Sha：软件，方法学。 Tianchi Tian：方法学，研究。 Tianyang You：写作 – 初稿，方法学，研究，概念化。

未引用参考文献

Tang等人，2025年；Zatsepin等人，2002年；Zhao等人，2021年。

数据可用性

数据可根据请求提供。

作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的竞争性财务利益或个人关系。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了中国国家自然科学基金（Grant编号：32372583）的支持。

Tianyang You | Zekun Sha | Tianchi Tian | Kaiyuan Zheng | Yuan Ding | Xiude Hua中国农业与林业生物安全国家重点实验室，南京 210095，中国