《Stress》：Identification of genes and pathways associated with chronic restraint stress-induced anxiodepressive-like behaviors in female mice by transcriptomic and genome-wide DNA methylation combinational-analysis
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女性患抑郁症和焦虑症的风险高于男性，然而针对女性特异性精神障碍（如围产期和围绝经期抑郁症）的生物学机制及药物治疗研究仍不充分。DNA甲基化（DNA methylation）作为一种关键表观遗传修饰，已被认为参与抑郁症发病。研究人员将雌性小鼠暴露于慢性束缚应激（
女性患抑郁症和焦虑症的风险高于男性，然而针对女性特异性精神障碍（如围产期和围绝经期抑郁症）的生物学机制及药物治疗研究仍不充分。DNA甲基化（DNA methylation）作为一种关键表观遗传修饰，已被认为参与抑郁症发病。研究人员将雌性小鼠暴露于慢性束缚应激（chronic restraint stress, CRS）2周，诱导出抑郁样和焦虑样行为，随后取内侧前额叶皮层（medial prefrontal cortex, mPFC）这一参与抑郁症病理生理的关键脑区，收集基因组DNA与总RNA，进行RNA测序（RNA sequencing, RNA-Seq）与全基因组酶法甲基化测序（whole-genome enzymatic methylation sequencing, EM-seq），以探究应激相关的转录与表观遗传改变。转录组分析在CRS暴露小鼠mPFC中鉴定出105个上调与71个下调基因；CRS上调补体与凝血级联相关基因，下调神经递质受体及其下游信号调节分子与神经元活性标记物。表观遗传谱揭示6848个高甲基化区域与4530个低甲基化区域，CRS同时改变CG与CHH型DNA甲基化。整合分析发现13个下调且显著高甲基化基因（多参与神经元活性调节）与8个上调且低甲基化基因。结果表明，雌性mPFC中CRS诱导的CG与CHH位点DNA高甲基化可能促成应激性转录失调，进而驱动焦虑抑郁样行为，为性别特异性应激反应的表观遗传机制提供新见解。
研究背景方面，重度抑郁症（major depressive disorder, MDD）全球疾病负担沉重，女性终生患病率约为男性1.7倍，这种差异自青春期显现并持续至中年，可能与性激素波动、应激易感性及脑结构功能差异有关。尽管表观遗传修饰为环境—基因互作提供分子框架，内侧前额叶皮层（mPFC）作为整合认知、情绪与生理应激反应的关键枢纽，对慢性应激高度敏感，但既往多数转录组与甲基化研究在雄性小鼠开展，雌性mPFC中应激诱导的甲基化组与转录组关系不清，限制了对围产期、围绝经期等女性特异性抑郁焦虑机制的解析与药物开发。为此，研究人员在《Stress》发表该研究，利用雌性C57BL/6J小鼠慢性束缚应激（CRS）模型，联合RNA-Seq与EM-seq在mPFC层面揭示性别特异性表观转录机制。
主要关键技术方法上，研究人员选用7–9周雌性C57BL/6J小鼠（河南斯克贝斯生物科技有限公司），经阴道细胞学确认90%以上处于动情间期后随机分组；CRS组单笼每日束缚4小时连续14天，对照组同室 undisturbed。行为学于昼夜光期依次进行强迫游泳（forced swimming test, FST）、蔗糖偏好（sucrose preference test, SPT）、社交互动（social interaction test, SIT）、高架十字迷宫（elevated plus maze, EPM）、旷场（open field test, OFT）与悬尾（tail suspension test, TST）。行为结束后24小时取mPFC（含边缘前与边缘下亚区），RNA-Seq每组建3个生物学重复（每重复混3只），EM-seq每组混2只取1样本，分别由广州金域生物完成Illumina NovaSeq X Plus测序；差异基因用DESeq2（|log2FC|>1且P<0.05），甲基化用BSMAP比对、methylKit检DMC/DMR（CG差≥0.25、CHH差≥0.15，q≤0.05），并做GO/KEGG富集与甲基—转录整合。
研究结果部分，3.1节显示CRS显著降低蔗糖偏好（P<0.001）、延长FST与TST不动时间（P<0.05），SIT无变化，证实雌性抑郁样表型。3.2节中OFT中心区距离与进入次数减少（P<0.05/P<0.01），EPM开臂进入、时间比、距离均降（P<0.05/P<0.01），总路程不变，表明焦虑样而非运动改变。3.3节RNA-Seq得176 DEGs（105上/71下），GO富集于胶原三聚体、胞外区、G蛋白偶联受体复合体等，KEGG富集神经活性配体—受体互作、cAMP信号、可卡因/安非他明成瘾与酪氨酸代谢；CRS上调C1qtnf3、ficolin A、C2、血栓反应蛋白1、凝血因子X/V等补体凝血基因，下调Gabrq、Htr1d、Drd1/2、Grin2b、Pde10a/7b及Arc、Egr2、Npas4、Creb5等神经元活性基因；与公开雄性CUMS数据及Xiong等meta分析存在方向一致重叠（χ2检验P<0.001）。3.4节EM-seq获约6.32亿clean reads/样本，映射率~92.5%，鉴定11378 DMRs（6848高/4530低），高甲基DMR中CG占51.76%、CHH占40.2%，低甲基DMR中CG占64.75%、CHH占28.98%；CG-DMR基因GO富集神经系统发育、神经发生，KEGG富集轴突导向、肾上腺能/胆碱能/谷氨酸能突触传递、Rap1/cGMP-PKG/cAMP信号；CHH-DMR类似富集神经发育与神经营养素通路。3.5节整合发现81甲基区落于40 DEGs，72在基因体；聚焦转录抑制逻辑，获13个“下调+高甲基”基因（Slc35d3、Six3、Hs6st3、Pde10a、Prdm1、Pde7b、Npas4、Creb5、Calcr、Adora2a、Tacr3、Syt2、Cntnap5c），其中6个伴CHH高甲基（Pde10a、Calcr、Adora2a、Tacr3、Syt2、Cntnap5c），IGV展示Hs6st3、Cntnap5c、Pde10a位点高甲基；另获8个“上调+低甲基”基因（Wfikkn2、Padi6、Daw1、Alx4为CG低甲基；Prdm6、Slc6a12、Cdcp3、Pax1为CHH低甲基）。
讨论与结论部分，研究人员指出慢性应激经DNA甲基化重编程扰乱mPFC转录，本研补足雌性空白：CRS在雌性mPFC引发补体（C1qtnf3、C2等）与凝血因子上调，佐证神经炎症—补体修剪假说；神经递质受体（GABAAθ、5-HT1D、D1/D2、NMDA2B）及活性基因（Arc、Npas4、Creb5）下调，呼应mPFC突触传递受损。表观层面，除经典CG高甲基外，CHH高甲基（神经元富集的非CG甲基化）亦沉默Pde10a、Adora2a、Syt2等，拓展非CG甲基化在应激转录调控中的角色。13个高甲基下调基因多属神经元活性/抑制性突触（NPAS4维持前额叶抑制回路、SYT2为PV阳性GABA能末梢标记、PDE10A调控cAMP/cGMP、TACR3关联谷氨酸能CaMKII），其高甲基—低表达可能是雌性焦虑抑郁样行为的表观驱动链。局限含样本混池掩盖个体变异、行为测试史与停应激后4天取材的时间干扰、缺qPCR验证、EM-seq仅n=2混样。结论原文意译：CRS在雌性mPFC诱导CG与CHH上下文DNA高甲基化，可能通过扰乱神经元活性与突触功能促进焦虑抑郁样行为，为应激相关障碍的性别特异性表观遗传机制提供新见解。
