《Brain Research Bulletin》：Methotrexate induces alterations in one-carbon metabolism and in plasmalogen and phosphatidylcholine levels in CSF of juvenile rats
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鞘内注射甲氨蝶呤（MTX）改变幼年大鼠脑脊液（CSF）代谢组；一碳代谢（OCM）被鞘内MTX给药所扰乱；赋形剂给药不产生CSF代谢组学改变；MTX诱导CSF脂质丰度的显著改变；MTX暴露后缩醛磷脂和磷脂酰胆碱富集。
鞘内注射甲氨蝶呤（MTX）改变幼年大鼠脑脊液（CSF）代谢组；一碳代谢（OCM）被鞘内MTX给药所扰乱；赋形剂给药不产生CSF代谢组学改变；MTX诱导CSF脂质丰度的显著改变；MTX暴露后缩醛磷脂和磷脂酰胆碱富集。
甲氨蝶呤对幼年大鼠脑脊液一碳代谢及缩醛磷脂和磷脂酰胆碱水平的影响：论文解读
一、研究背景与目的
急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia, ALL）是儿童最常见的恶性肿瘤之一。尽管治疗方案的改进使5年生存率接近90%，但化疗引起的神经毒性导致40%–70%的ALL幸存者出现多领域认知功能障碍，即化疗相关认知障碍（chemotherapy-related cognitive impairment, CRCI）。甲氨蝶呤（methotrexate, MTX）作为儿童ALL化疗方案的核心药物之一，已被证实可诱导空间和工作记忆缺陷，但临床联合化疗中难以区分单一药物的贡献。脑脊液（cerebrospinal fluid, CSF）代谢组学能够反映脑内代谢状态，是识别治疗相关变化的有效工具。然而，目前缺乏在无白血病背景下对MTX暴露后CSF代谢组进行纵向、高覆盖表征的研究。为此，研究人员利用幼年大鼠模型，通过行为学测试和超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）代谢组学分析，探讨MTX单独给药对CSF代谢谱的影响。
二、研究设计与方法
研究人员采用Long Evans幼年大鼠（N=40，雄雌各半），实验组接受MTX（腹腔注射0.5 mg/kg，共6次；鞘内注射1 mg/kg，共4次），对照组接受PBS和人工脑脊液。在第一次（IT1）和最后一次（IT4）鞘内注射时点采集CSF，对预先设定亚组（每组每性别6只）进行非靶向代谢组学分析，共检测385种代谢物。行为学测试在给药结束后进行，包括旷场（open field, OF）测试评估运动活性和焦虑样行为，物体位置（object placement, OP）测试评估空间记忆，新物体识别（novel object recognition, OR）测试评估视觉记忆。数据分析采用KEGG通路拓扑分析、三因素方差分析（ANOVA）和过表达分析（ORA）。
三、主要技术方法
研究使用了以下关键技术：1）幼年大鼠MTX给药模型（Long Evans品系，雌雄各半），模拟临床儿科方案，结合腹腔和鞘内注射；2）CSF采集（经小脑延髓池穿刺）；3）行为学测试（OF、OP、OR）；4）UPLC-MS/MS非靶向代谢组学（Metabolon平台）；5）KEGG通路分析和三因素ANOVA（处理、时点、性别）及ORA富集分析。
四、研究结果
（一）MTX诱导空间和视觉记忆损伤
OP测试中，MTX处理大鼠偏好分数（51.5%）显著低于对照组（66.5%，p=0.020），表明空间记忆缺陷；OR测试中，MTX组偏好分数（47.5%）显著低于对照组（61.5%，p=0.011），表明视觉记忆缺陷。OF测试显示两组总路程和中央停留时间无显著差异，排除了运动或焦虑样行为对认知结果的影响。
（二）MTX干扰一碳代谢
比较MTX处理大鼠IT1与IT4时点的CSF代谢组，研究发现“叶酸介导的一碳池”（impact=0.361，FDR=1.99E-06）和“半胱氨酸与蛋氨酸代谢”（impact=0.534，FDR=1.99E-06）是富集最显著的通路。代谢物层面，蛋氨酸（倍数变化=3.24E-06，FDR=6.41E-06）和S-腺苷甲硫氨酸（SAM，倍数变化=0.364，FDR=0.027）水平下降，半胱氨酸（倍数变化=2.809，FDR=0.016）和胱硫醚（倍数变化=3.973，FDR=0.001）水平上升，符合MTX抑制叶酸循环、破坏蛋氨酸循环的机制。PBS处理组未观察到类似变化，证实这些改变可归因于MTX治疗。
（三）MTX改变CSF甘油磷脂丰度
通过三因素ANOVA分析处理主效应，发现脂质是唯一显著过表达的代谢物类别，84种脂质中有38种丰度发生改变（富集度=2.35，FDR=5.66E-03）。其中，“甘油磷脂和甘油磷脂代谢”亚通路富集显著（富集度=3.23，FDR=7.06E-07）。进一步细分显示，仅“缩醛磷脂”（富集度=3.8，FDR=1.06E-03）和“磷脂酰胆碱”（富集度=3.22，FDR=2.53E-03）两个亚通路显著富集。
（四）缩醛磷脂和磷脂酰胆碱水平升高
检测到的9种缩醛磷脂中有8种，12种磷脂酰胆碱中有9种受MTX显著影响。在IT1时点，所有显著改变的缩醛磷脂和磷脂酰胆碱在MTX处理大鼠中均较对照组升高，且两性均存在；在IT4时点，雄性MTX大鼠仍呈现升高，而雌性大鼠大多未显示出显著差异。例如，IT1时，MTX雄性大鼠的1-(1-enyl-stearyl)-2-docosahexaenoyl-GPE（P-18:0/22:6）升高2.1倍（p=0.0253），雌性升高2.9倍（p=0.0157）。IT4时，MTX雄性大鼠1-palmitoyl-2-oleoyl-GPC（16:0/18:1）升高1.5倍（p=0.022）。这些结果提示MTX对CSF磷脂水平具有显著且广泛的调控作用。
五、讨论与结论
本研究利用幼年大鼠模型证实，单独MTX暴露即可引起空间和视觉记忆缺陷，并导致CSF一碳代谢和甘油磷脂谱的显著改变。缩醛磷脂和磷脂酰胆碱的升高可能反映MTX相关的髓鞘或细胞膜应激，且磷脂酰胆碱合成依赖于SAM介导的甲基化，因此与一碳代谢紊乱存在生化联系。性别相关的差异模式提示未来需在充分统计功效下评估性别效应。研究的局限性包括CSF采样时点有限、IT1并非治疗前基线、未直接探究代谢变化与行为缺陷的因果关系。总体而言，本研究为理解临床ALL患者化疗后CSF代谢组变化提供了实验依据，支持进一步开展靶向脂质组学验证和机制研究。
