《TRENDS IN Microbiology》：The multifaceted role of atomic force microscopy in bacteriology
原子力显微镜（AFM）已成为一种强大的工具，可在近天然条件下实时提供活细菌细胞被膜的空间组织、生物力学和分子间相互作用的纳米尺度见解。聚焦近年文献，我们讨论了AFM如何推进对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和分枝杆菌细胞被膜结构，以及已有和新型抗菌药物作用机制的理解。我们还总结了AFM如何通过单分子和单细胞力谱来探测病原体的黏附、毒力和免疫逃逸。
理解细菌细胞被膜
细菌细胞被膜对生存至关重要，是细菌与环境之间的动态界面，既能实现营养摄取和黏附，又能提供针对竞争者、宿主免疫系统和抗生素等有毒分子的保护。革兰氏阳性菌具有细胞质膜和富含磷壁酸的厚肽聚糖层，这些成分有助于维持结构和参与细胞过程。相比之下，革兰氏阴性菌具有较薄的肽聚糖层，并额外拥有包含脂多糖（LPS）、磷脂、蛋白质和脂蛋白的外膜。一些细菌还拥有所谓的表层（S-layer），即由一种或多种S层蛋白构成的二维晶格。在某些细菌中，细胞被膜外还被荚膜包围，荚膜是胞外聚合层，有助于保护、免疫逃逸或黏附。分枝杆菌具有更复杂的被膜，其富含脂质的外层形成高度不可渗透的屏障，导致抗生素耐药性。
理解细菌细胞被膜的组织和动态对于揭示其功能复杂性、阐明抗菌机制以及指导靶向和/或克服细胞被膜的新治疗策略的开发至关重要。凭借其纳米级空间分辨率、提供结构和力学信息的多样性以及在液体中成像活细菌的能力，原子力显微镜（AFM）已成为应对这些挑战的有力工具。
什么是AFM？
AFM是一种纳米级分辨率、表面扫描的成像技术，通常用作材料科学中的表面表征方法，提供表面形貌、力学和电学性质信息。它通过扫描位于柔性悬臂末端的尖锐探针横跨样品来绘制表面图。随着探针在表面移动，它会响应突起或孔隙等局部特征。存在许多成像模式，通常包括探针位置的垂直调制，但它们的共同点是利用探针追踪表面轮廓并通过AFM形貌重建样品表面的三维形貌图像。某些模式还通过额外数据通道提供对比度，如AFM相位图。当使用力谱记录力-距离曲线时，AFM还能确定样品的力学性质，如黏附力和刚度。此外，当AFM探针功能化有分子甚至整个细菌时，AFM能够测定细胞间或分子水平的黏附特性。
AFM自20世纪90年代起用于生物学，而细菌学是过去5至10年间取得重大进展的领域。在生物学背景下，AFM的主要优势在于它能在液体中、近天然状态下、实时地以纳米级分辨率对功能性生物分子和活细胞成像。AFM不需要像电子显微镜（EM）等其他高分辨率成像技术那样要求样品冷冻、固定或金属镀膜；也不依赖于样品干燥，虽然干燥样品当然也兼容AFM。相比之下，超分辨荧光显微镜可用于研究细胞蛋白的动态，但只能解析带有荧光标记的分子。由于AFM依赖物理探针-样品相互作用而非透镜或荧光，因此无需标记即可在近天然环境中实时追踪生物样品在纳米尺度的动态。
然而，和所有分析技术一样，AFM也有固有的局限性。AFM在生物样品上操作的艺术性之一在于控制探针-样品相互作用，使其足够强以提供充分对比度，但又不能太强以致损伤探针或样品。另一个关键限制是通量：搭建AFM实验可能费时费力，尽管现代商用AFM系统通过自动化已极大改善了这一点；图像逐线构建，采集时间从每帧数分钟到最佳情况下高速AFM在相对平坦且亚微米扫描区域达到每秒数十帧不等。此外，样品需要固定在固体支撑物上，这意味着样品制备很重要，而且虽然AFM提供表面形貌，但它并不能测量完整的三维结构。
原子力显微镜探测细胞被膜结构
革兰氏阳性菌
多种成像方法已被用于研究革兰氏阳性菌的细胞被膜，包括用超分辨光学显微镜追踪新肽聚糖的合成，以及用SEM和TEM评估结构异质性和孔隙率。
AFM通过提供无标记结构成像以及活细胞力学测量来补充这些方法。例如，AFM能够识别金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌肽聚糖细胞壁中两个不同区域：多孔、无序的成熟层和由同心肽聚糖环组成的致密新生区域。将液相AFM与超分辨成像相结合，揭示了枯草芽孢杆菌中肽聚糖合成的不均匀性，其发生在与致密结构区域对应的离散条带中。它还阐明了青霉素结合蛋白（PBP）1通过其转肽酶活性及其PASTA结构域在协调隔膜板形成和产生同心环隔膜结构中的作用。这种关联成像还揭示了DivIC调控主要肽聚糖合酶PBP2和FtsW在分裂隔膜处的空间定位，从而控制隔膜结构和细胞壁完整性。
FtsZ等细胞骨架蛋白对分裂至关重要。高速液相AFM数据与模拟相结合，证明纯化的FtsZ丝能形成有序结构。FtsZ具有GTP酶活性，可将GTP水解为GDP。GDP的结合使FtsZ聚合成长丝。在GTP酶活性降低的菌株中，长丝变得无序。
除阐明肽聚糖合成外，AFM还揭示了细胞壁水解酶的作用。缺失40种水解酶的枯草芽孢杆菌菌株（Δ40）仍能存活，但如空气AFM观察所示，其细胞壁表面粗糙度增加且网孔密度改变。这项研究强调了这些酶的冗余性和可舍弃性，并证明细胞壁结构的改变可被细胞耐受。
环境效应也已被探索；例如，液相AFM揭示湿度变化会诱导枯草芽孢杆菌孢子发生可逆的体积和刚度变化。
液相AFM探索的其他表面特性还包括细菌力学和黏附。在单核细胞增生李斯特菌中，选择性去除共价连接于肽聚糖的表面蛋白（LPXTG蛋白）和碳水化合物（壁磷壁酸和脂磷壁酸）在不引起重大形态变化的情况下改变了细胞刚度和对氮化硅表面的黏附，证明了它们在决定力学完整性和黏附特性中的关键作用。
某些细菌具有S层。在炭疽芽孢杆菌中，表达两种互斥的S层蛋白：指数生长期的Sap和稳定期的EA1，两者在晶格组织和表面性质上均有差异。液相AFM研究表明，缺失Sap导致表面粗糙度增加、形态皱缩和刚度降低，而EA1突变体则与野生型细胞相似。值得注意的是，当EA1补偿Sap的缺失时，细胞保持类野生型的形态和力学；若无此补偿，细胞变软且结构受损。这些发现表明S层的组成和组装控制被膜力学，可能通过蛋白质相互作用的差异及其与下方细胞壁的偶联实现，S层充当承重外骨骼。
革兰氏阴性菌
革兰氏阴性菌的细胞被膜由被薄层肽聚糖隔开的两层膜组成。某些物种有荚膜，但所有物种都有外膜，其外小叶含LPS，内小叶含磷脂。外膜还含有众多介导多种功能的蛋白质。
三聚体孔蛋白是多个研究充分物种（如大肠杆菌）中最丰富的外膜蛋白之一，在外膜中形成紧密堆积、富含蛋白质的网络，而外膜中的其他结构域富含LPS。这种孔蛋白和LPS的异质分布最初由AFM发现并由超分辨显微镜证实，突显了这些方法的互补性：超分辨显微镜识别特定分子（通过标记选择）的组织，而AFM提供膜形貌的无标记纳米尺度视图。
外膜是细胞被膜的关键结构元件，通过OmpA（一种八链β-桶）连接至肽聚糖。液相活大肠杆菌AFM成像表明，OmpA还促进外膜蛋白有序网络的形成，有效充当这些网络的肽聚糖结合锚。另一种连接外膜和肽聚糖细胞壁的蛋白质Lpp被发现调控周质间隙。虽然EM确立了其结构作用，但液相AFM通过结合成像和力谱揭示了其在活细胞中的力学贡献：lpp的突变或缺失并未显著改变表面形貌，但导致明显的细胞软化，在缺乏Lpp、表达延长型Lpp或Lpp与肽聚糖脱离的菌株中观察到刚度降低。此外，空气AFM对纯化囊状体的成像能够直接可视化大肠杆菌肽聚糖外表面上大小均匀（约18 nm）的颗粒状Lpp结构，并在分裂期间从隔膜位点排除。
AFM还被用于绘制丰度较低蛋白质的表面分布。铁-铁载体转运蛋白FepA被证明嵌入孔蛋白网络并基本不可移动，由周围糖脂稳定。其定位通过结合液相AFM与ColicinB-mCherry探针检测，探针特异性结合FepA并在AFM图像中表现为高度最大值。
液相AFM还揭示了涉及其他蛋白质的力学效应。例如，关键外膜通道TolC的失活导致膜比野生型细胞更光滑、更柔软。
除蛋白质外，基于AFM的力谱已被用于研究膜磷脂组织，这是一个高度调控的过程。例如，多组分Mla系统通过从外小叶移除磷脂来维持外膜脂质不对称性。外小叶中磷脂的生物力学影响通过液相AFM得以证明，其显示MlaA缺陷的铜绿假单胞菌菌株的细胞被膜比野生型更硬。AFM研究证明了通过mlaA缺失对该系统的破坏。
MlaA的作用在大肠杆菌中通过液相AFM成像进一步研究，但MlaA缺陷突变体未发现可区分的表型。然而，mlaA和pldA的双重缺失导致细菌表面出现磷脂结构域，表明这两个基因在膜稳态中的关键作用。
AFM也被用于研究环境响应；如AFM所探测，鲍曼不动杆菌的长期脱水导致异质力学性质，水合细胞比脱水细胞表现出更高黏附。
在细菌细胞分裂背景下，AFM揭示大肠杆菌中形成隔膜区域的局部刚度高于周围细胞被膜。液相高速力作图显示这种硬化是瞬态和动态的，与隔膜形成的进展和随后细胞分离过程中的重塑一致。
分枝杆菌
与革兰氏阴性菌相比，分枝杆菌细胞被膜具有不同类型的外膜——所谓的分枝菌酸外膜，以及阿拉伯半乳聚糖和脂阿拉伯甘露聚糖等额外多糖，脂质含量为40–60%。
在分枝杆菌中，AFM提供了表面组成和疏水性的见解。脓肿分枝杆菌可通过上调或下调糖肽脂水平产生光滑型和粗糙型菌落。通过这种方式，在感染期间，脓肿分枝杆菌可以从定植的光滑型形态转变为毒力更强的粗糙型形态。光滑型和粗糙型变体表现出相似的AFM形貌，但液相记录的表面黏附特性不同；粗糙型菌株表现出均匀的高疏水性，而光滑型菌株表现出不同疏水性的异质纳米结构域。抑制分枝菌酸转运增加了两种类型的表面粗糙度并降低了疏水性。
液相AFM还显示，分枝杆菌从标准条件下的较硬状态转变为巨噬细胞内的较软力学形态，这种软化与改善的生存和应激适应相关。
最后，液相AFM被用于研究结核分枝杆菌纯化肽聚糖中的细胞壁重塑。VirR蛋白的缺失导致更厚的层和更小的孔，证明了该蛋白在调控细胞壁结构中的作用。
抗生素作用机制与耐药性
在基于上述更基础的细菌细胞被膜研究基础上，AFM越来越多地被用于研究抗生素和其他药剂如何靶向被膜。AFM对抗菌肽、细菌素和相关化合物破坏模型膜的研究已有长久历史，并被广泛综述。在此，我们聚焦于涉及临床相关和新发现抗生素以及补体系统膜靶向组分在模型膜和活细胞上的最新进展，反映了补体耐药性在细菌发病机制中的重要性。
甲氧西林
甲氧西林是靶向PBP2的第二代青霉素类β-内酰胺。在耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）中，获得mecA通过编码PBP2a赋予甲氧西林耐药性，PBP2a是一种对抗生素亲和力降低的PBP，可补偿被抑制的PBP2转肽酶活性。然而，PBP2a不能替代PBP2的转糖基酶功能，尽管PBP2/PBP2a异二聚体可维持两种活性。PBP2驱动整体肽聚糖合成，而PBP1和FtsW对分裂期间隔膜形成至关重要。利用高分辨率空气和液相AFM，Adedeji-Olulana等人首次证明了β-内酰胺胁迫下细胞壁纳米尺度结构的变化。通过自动化图像分析，发现在无抗生素胁迫下，SH1000和SH1000 mecA的分裂隔膜呈现同心环结构。隔膜处同心环的形成被证明依赖于PBP1活性。在甲氧西林存在下，SH1000 mecA未出现明显同心环。相反，隔膜外表面表现为无序的网状结构，且整体细胞壁更薄。亲本SH1000菌株在相同胁迫下死亡，细胞壁上出现贯穿孔洞。
一个高耐药MRSA菌株（mecA伴rpoB突变）在无甲氧西林时与SH1000 mecA相似。在高浓度甲氧西林存在下，SH1000 mecA rpoB*能够生长和分裂，但子细胞上完全缺乏肽聚糖同心环结构。作者随后证明rpoB突变使MRSA菌株能够补偿PBP1活性的缺失。具体而言，这些突变允许了一种无需隔膜环的替代细胞分裂模式。
替索巴丁和克洛维巴丁
替索巴丁和克洛维巴丁是两种新发现的天然肽类抗生素，通过不同机制抑制细胞壁合成。替索巴丁结合肽聚糖前体脂质II，结构研究提示它可能还结合相关前体，如脂质I和壁磷壁酸前体脂质III。相比之下，克洛维巴丁直接靶向多种前体共有的焦磷酸部分，包括脂质II、C55PP和脂质III。AFM对解析两种机制至关重要：高速液相AFM实时捕捉了每种抗生素在细菌模型膜上成核并组装成超分子原纤维的过程，直接可视化这种纤维生长如何隔离前体并使膜变形。
多黏菌素
多黏菌素靶向革兰氏阴性菌外膜中的LPS。早期对鲍曼不动杆菌的空气AFM研究表明，暴露于多黏菌素E（又称黏菌素）会诱导浓度依赖性形态变化，从轻微表面缺陷到严重膜破坏，突出了敏感和耐药细胞之间的差异。基于这些发现，缺乏N端酰基链的多黏菌素衍生物如SPR741被发现以不同方式破坏外膜。液相AFM显示SPR741在大肠杆菌中诱导剂量依赖性膜波动和纳米级间隙，增强抗生素摄取而不显著影响内膜，这与天然多黏菌素B不同。
AFM和单分子力谱已被用于研究多黏菌素B与LPS的相互作用，揭示结合后膜粗糙度和褶皱增加。力测量进一步量化了这些相互作用，显示多黏菌素B与LPS之间的解绑力约为30 pN。
对水溶液中活大肠杆菌的液相AFM观察表明，多黏菌素并未破坏外膜蛋白网络，而是在大肠杆菌表面诱导形成20–40 nm高的、均匀分布的突起。这些突起与细菌杀灭相关：突起和杀灭均发生在指数期细菌中，而在稳定期细菌中除非存在碳源否则不发生。这使得发现多黏菌素致死性需要代谢活性，且致死性依赖于LPS从外膜的过量产生和脱落。
后一项研究还突显了全细胞AFM在此背景下的重要性：早期对大肠杆菌塌陷纯化外膜囊泡（OMV）的液相AFM工作曾提示多黏菌素诱导约10 nm周期性的结晶LPS晶格，但在全细胞上未观察到此类效应。
达托霉素
达托霉素是一种环状脂肽抗生素，靶向革兰氏阳性菌的膜。Zuttion等人将高速液相AFM与互补显微术结合研究达托霉素在模型膜上的作用，显示了两种浓度依赖性膜破坏机制：在低浓度下，寡聚导致膜凹陷、转位和环形孔形成；而在较高浓度下，达托霉素诱导膜突起和管状化，导致失稳。
膜心磷脂含量增加——这是肠球菌和葡萄球菌耐药性的相关特征——通过阻止内膜小叶转位并将响应从破裂转变为膜屈曲来改变这种活性，与脂质体研究一致。
AFM也被用于研究达托霉素在活细胞中的作用，特别是在金黄色葡萄球菌中。与SEM结合，液相AFM揭示了在治疗数分钟内快速的纳米尺度表面变化，包括粗糙度增加和局部细胞壁破坏。SEM提供更广泛的群体水平成像，而AFM则能够对单个活细胞进行高分辨率动态形态变化追踪。
AMC-109
AMC-109（原名LTX-109）是一种有前景的阳离子、膜作用型人工三肽抗生素，能杀灭MRSA和耐万古霉素金黄色葡萄球菌菌株。液相高速AFM已被用于阐明AMC-109在模型膜上的作用机制。这揭示了一个独特的两步过程：AMC-109首先自组装成约3–4 nm的阳离子聚集体，选择性停靠到带负电的膜上。随后，它插入外小叶，聚集并溶解天然脂质纳米结构域而不形成明显孔洞。这种机制不同于蜂毒肽等成孔肽，而更类似于乙醇和苯扎氯铵等小消毒剂分子，使作者将AMC-109表征为细菌选择性去垢剂。
达罗巴丁
达罗巴丁是一种天然肽类抗生素，通过抑制BamA（β-桶组装机器（BAM）的核心插入酶，负责折叠外膜蛋白）靶向革兰氏阴性菌。不同于成像膜形貌，液相单分子力谱被用于机械展开BamA富集OMV中的单个BamA分子，从而测量其不同区域[多肽转运相关（POTRA）结构域、连接区、β-发夹]的稳定性，并证明达罗巴丁结合于侧向门并选择性硬化连接区和一个POTRA结构域，通过限制其将新蛋白插入外膜所需的灵活性将BamA锁定在抑制状态。
膜攻击复合物
补体是先天免疫系统的关键组分，通过形成膜孔杀灭病原体；对补体的耐药性是主要毒力因子。
终末通路形成膜攻击复合物（MAC），由C5b–C9蛋白组成，它们顺序组装以穿透革兰氏阴性菌的外膜。包括冷冻电镜在内的高分辨率结构研究已解析了MAC的结构，而液相高速AFM在模型膜上可视化其从C5b–C7募集到快速C9聚合和约10 nm孔形成的逐步寡聚过程。
液相AFM已显示大肠杆菌外膜中广泛的MAC孔形成，并强调了局部C5切割和C5b6组装的重要性。然而，外膜孔的形成并未立即导致内膜通透和裂解。相反，细胞死亡涉及进行性被膜失稳、膨胀、硬化和最终裂解。最近，超分辨显微镜表明MAC优先定位于细胞两极，补充了AFM对孔形成和实时膜损伤的观察。
研究细胞黏附
除成像外，AFM还通过单分子力谱和单细胞力谱广泛用于探测单分子和单细胞水平的黏附。这些方法依赖于功能化的AFM探针，其携带单个生物分子或整个细菌细胞，以高精度研究配体-受体和黏附相互作用。
单细胞力谱
对铜绿假单胞菌的研究使用单细胞力谱将表面结构与黏附、生物膜形成和毒力联系起来。多个因素与该菌的生物膜形成和发病机制相关，特别是IV型菌毛和Pel、Psl等胞外多糖的产生。O抗原血清型的变化被证明可增加对疏水表面的黏附并增强对宿主防御的抵抗力，部分通过稳定IV型菌毛实现。进一步的工作确定IV型菌毛和胞外多糖是细胞黏附疏水底物的主要贡献者。AFM力测量还揭示菌毛尖端蛋白PilY1充当机械传感器，经历力依赖性构象变化来调节黏附强度和生物膜形成，特定突变显著降低黏附力和生物膜发展。
血管性血友病因子是一种机械敏感的血糖蛋白，对止血和凝血至关重要。Chantraine等人使用单细胞力谱表明，表皮葡萄球菌对血管性血友病因子的黏附由积累相关蛋白（Aap）介导，Aap是生物膜形成的关键因子。Aap缺失显著降低结合概率，突显其在表面黏附中的核心作用。此外，表皮葡萄球菌利用巨型黏附素Embp实现对纤维化纤连蛋白特别强的、多价的“维可牢”样黏附，使其能够牢固附着于宿主和植入物表面。
单分子力谱
在葡萄球菌属中，单分子力谱揭示了细菌黏附素与宿主蛋白之间异常强的结合，力常从几十pN到多nN水平，并强烈依赖于机械加载条件。例如，表皮葡萄球菌Aap与血管性血友病因子之间的相互作用达到2.5–3.5 nN的断裂力，在更高加载速率下观察到更大的力，提示力增强结合。
在金黄色葡萄球菌中，血管性血友病因子结合涉及ClfA和vWbp蛋白，它们可能协同作用产生约2 nN的黏附力，提示一个能够承受血流的机械稳健复合物。
在上皮表面，金黄色葡萄球菌通过纤连蛋白结合蛋白B黏附于loricrin产生约0.1至2 nN的异质断裂力，纤连蛋白结合蛋白B耗竭后黏附显著降低。这些发现在角质细胞中得到验证，并再次显示在机械应力下键强度增加。Zheng等人还揭示了不同的纤连蛋白结合蛋白B结构域如何调节配体特异性，将分子结构与黏附力学和功能联系起来。类似地，黏附素SdrD以高达约2 nN的“超强”非共价力结合桥粒芯蛋白-1，接近共价键强度，而钙耗竭则显著将黏附降低至pN范围，突显了该相互作用的离子依赖性稳定性。
单分子力谱也被应用于免疫逃逸机制。在结核分枝杆菌中，与树突状细胞受体DC-SIGN（树突状细胞特异性细胞间黏附分子-3-抓取非整合素）的结合发生在约27 pN，跨物种结合动力学相似，但结合频率差异与细菌表面配体聚集相关。在金黄色葡萄球菌中，通过SdrE募集补体调节因子H因子产生非常强的相互作用（1.35–1.45 nN），在更高加载速率下进一步增强，强化了细菌在免疫压力下的生存。
总体而言，这些研究表明单分子力谱可以定量黏附强度，并揭示机械力、分子组织和环境因素如何调节细菌附着和免疫逃逸。
结论
AFM是微生物学中高度多功能的工具，近年来其应用范围得到了进一步拓展。它揭示了详细的细菌细胞被膜结构，从革兰氏阳性菌复杂的肽聚糖到革兰氏阴性菌外膜蛋白的纳米尺度组织，并通过将结构与力学和生理学联系起来，推进了我们对细胞被膜功能、应激反应和抗生素敏感性的理解。
AFM还阐明了抗菌机制，包括达托霉素诱导的膜破坏、MRSA中β-内酰胺驱动的重塑、多黏菌素诱导的膜重构，以及达罗巴丁和补体膜攻击复合物在分子和细胞尺度上的作用。
此外，力谱通过测量配体-受体相互作用，为细菌黏附和免疫逃逸提供了定量力学见解。
新兴方法，如关联成像和高速AFM，有望带来进一步进展，特别是在表征新型潜在临床抗生素候选物方面，但需要仔细权衡分辨率、复杂性和生理相关性。
