《Cellular Signalling》：TRIM41 stabilizes RBPJ through K63 linked ubiquitination and promotes stemness of hepatocellular carcinoma cells
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摘要Notch信号通路的持续激活与肝癌干细胞（CSCs）的维持及肝细胞癌（HCC）的进展密切相关。重组信号结合蛋白（RBPJ）是介导Notch通路下游靶基因转录的关键转录因子，但其在促进HCC中CSC特征方面的作用尚未得到充分阐明。在本研究中，我们发现RBPJ在HCC中显著上
摘要
Notch信号通路的持续激活与肝癌干细胞（CSCs）的维持及肝细胞癌（HCC）的进展密切相关。重组信号结合蛋白（RBPJ）是介导Notch通路下游靶基因转录的关键转录因子，但其在促进HCC中CSC特征方面的作用尚未得到充分阐明。在本研究中，我们发现RBPJ在HCC中显著上调，且与特定的临床病理特征相关。RBPJ还促进了HCC细胞中的干性样表型。从机制上看，TRIM41与RBPJ相互作用，并介导RBPJ在Lys135位点的K63连接多聚泛素化，从而稳定RBPJ并增强RBPJ介导的干性相关基因SOX2和CD44的转录激活。因此，TRIM41–RBPJ轴维持了HCC细胞中的CSC样特性。我们的研究结果揭示了一种此前未被认识的翻译后修饰机制，即通过TRIM41介导的RBPJ稳定来促进干性样特性。这些发现扩展了我们对HCC中RBPJ翻译后调控的理解，并突出了TRIM41–RBPJ轴作为值得进一步研究的潜在分子靶点的重要性。
引言
肝细胞癌（HCC）是全球最常见的原发性肝脏恶性肿瘤之一，具有高复发率、显著异质性和临床预后不良等特征[1]，[2]。目前HCC的系统治疗主要包括酪氨酸激酶抑制剂（TKIs），如索拉非尼和仑伐替尼。尽管近年来联合免疫检查点抑制剂的策略发展迅速，但总体生存获益仍然有限，治疗耐药和肿瘤复发仍是实现疾病长期控制的主要障碍[3]。因此，阐明驱动HCC持续进展和治疗失败的分子机制，并识别可干预的靶点，具有重要的生物学和临床意义。
肿瘤干细胞（CSCs）是一类具有肿瘤起始、自我更新和分化能力的肿瘤细胞亚群，在转移、治疗耐药和复发中发挥关键作用[4]，[5]。在HCC中，CSCs与不良预后和治疗失败密切相关，凸显了以CSC为靶向的治疗策略作为有前景的治疗手段[6]。Notch信号通路是一种经典的发育信号级联，在维持肿瘤干性中发挥核心作用[7]。重组信号结合蛋白（RBPJ）作为经典Notch信号的核心转录效应因子，与Notch胞内域（NICD）协同形成转录激活复合物，直接诱导Notch靶基因转录[8]。先前的研究表明，抑制RBPJ可以缓解HCC中CD8+ T细胞的耗竭[9]。然而，RBPJ在HCC中持续维持CSC特性的分子基础仍未被完全阐明。
三段体基序（TRIM）家族是RING型E3泛素连接酶中最大的亚家族，通常以其保守的N端RBCC（RING-B-box-卷曲螺旋）基序为特征[10]。尽管许多TRIM蛋白已被发现参与肿瘤生物学过程，但许多家族成员在癌症发生和进展中的功能和机制作用仍未得到充分表征[11]。已有报道表明，TRIM41可介导PKD1蛋白的泛素化，并通过ANXA10–PKD1轴调节黑色素瘤转移[12]。然而，TRIM41是否参与HCC进展，特别是在调节CSC相关表型方面，尚未得到系统研究。
在本研究中，我们证明RBPJ在HCC中显著上调，且与特定的临床病理特征及干性相关特征密切相关。功能性和机制性分析进一步表明，RBPJ通过转录激活SOX2和CD44促进CSC表型的维持。我们对RBPJ免疫沉淀产物进行了液相色谱-串联质谱（LC–MS/MS）分析，鉴定出TRIM41为候选的RBPJ相互作用蛋白。后续实验证实了TRIM41与RBPJ的相互作用，并揭示TRIM41以RING结构域依赖的方式促进RBPJ在Lys135位点的K63连接多聚泛素化。该修饰与RBPJ的K48连接多聚泛素化及蛋白酶体降解减少相关。由此产生的RBPJ稳定增强了其对SOX2和CD44的转录激活作用。综上所述，我们的研究结果揭示了一种此前未被认识的机制，即TRIM41通过K63连接泛素化稳定RBPJ，从而在HCC中促进CSC特性，并为与干性相关的HCC进展提供了潜在的 therapeutic 靶点。
章节片段
试剂
本研究使用的多种试剂购自以下供应商：胎牛血清（Gemini Bio，加利福尼亚州萨克拉门托市），高糖DMEM培养基（Gibco，纽约州大岛市），青霉素-链霉素-两性霉素B混合液（NCM Biotech，中国苏州），Lipofectamine? 2000转染试剂（Invitrogen，加利福尼亚州卡尔斯巴德市），苯甲基磺酰氟（P0100，Solarbio，中国北京），含4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的封片剂（Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯市），Protein A + G磁珠（P2108，
RBPJ在HCC中上调，并与干性相关基因表达呈正相关
为了探究RBPJ在肿瘤组织与正常组织间的表达差异，我们利用TIMER数据库分析了TCGA数据库中不同肿瘤类型中RBPJ mRNA的表达水平。与正常组织相比，RBPJ mRNA在多种肿瘤类型中显著升高，包括肝细胞癌（LIHC）、胆管细胞癌（CHOL）、头颈鳞状细胞癌（HNSC）、肾透明细胞癌（KIRC）和胃腺癌（STAD）（图.
讨论
在肝细胞癌（HCC）中，肿瘤干细胞（CSCs）被认为是维持肿瘤异质性和驱动治疗失败的关键细胞群体[13]，[15]。因此，阐明调控CSCs的核心机制并开发有效的CSC靶向策略已成为主要的研究重点。Notch信号通路已被广泛证实与多种恶性肿瘤中干性的维持和治疗耐受性密切相关[14]，[16]，[17]。
CRediT作者贡献声明
武浩：撰写—初稿，方法，研究，形式分析，数据整理，概念构思。吴金巧：撰写—初稿，方法，研究，形式分析，概念构思。张新宇：方法，研究，形式分析，概念构思。姚宇昕：研究，数据整理。叶东杰：研究，数据整理。张竹：验证，方法。杨浩一：验证，方法。王小千：资源，项目管理。
资金支持
本研究得到以下资助项目的支持：国家自然科学基金（82372936）；福建省健康科技项目（2022CXA009）；福建省科技创新联合基金计划（2021Y9067）；福建省高层次医疗人才建设基金（[2021]76）。
武浩|吴金巧|张新宇|姚宇昕|叶东杰|张竹|杨浩一|王小千|唐南红
福建医科大学附属协和医院肝胆外科及福建省肝胆外科研究所，福建，福州350001
