亚砷酸钠会抑制ALKBH7的活性，从而增加线粒体呼吸链复合体附近的tRNA m2的甲基化程度，进而促进膀胱上皮细胞的恶性表型转变

《Chemico-Biological Interactions》：Sodium arsenite inhibits ALKBH7 increasing tRNA m2 2G methylation in mitochondrial respiratory chain complex-flankng to drive malignant phenotype of bladder epithelial cells

　　

摘要

砷暴露会增加膀胱癌的风险。对砷处理过的膀胱上皮细胞的蛋白质组学分析显示，NMES1的表达显著上调，这一结果在暴露于亚砷酸盐的小鼠的膀胱上皮细胞以及用0.5 μM亚砷酸盐处理的SV-HUC-1细胞中也得到了验证。NMES1是线粒体呼吸链复合体IV的一种核编码辅助蛋白。通过分子对接和蛋白质相互作用检测证实了ALKBH7与NMES1之间存在直接相互作用。ALKBH7是一种线粒体RNA去甲基化酶，在砷暴露的膀胱上皮细胞中其表达显著下调。砷介导的ALKBH7抑制作用提高了线粒体呼吸链中tRNA的m²₂G甲基化水平，同时降低了赖氨酸、精氨酸和甘氨酸的mRNA水平以及mt-CO2和mt-ND3的蛋白质表达，最终导致线粒体呼吸功能障碍。此外，砷暴露还增强了细胞糖酵解，为膀胱上皮细胞的增殖和迁移提供了能量支持。siNMES1缓解了砷引起的ALKBH7下调和细胞恶性表型。过表达的ALKBH7有效地减弱了砷所增强? 糖酵解和恶性表型。总之，砷通过上调NMES1来抑制ALKBH7的表达，从而增加了mt-tRNA的m²₂G甲基化修饰，并降低mt-CO2和mt-ND3亚基的表达，进而损害线粒体呼吸功能。抑制ALKBH7进一步促进了糖酵解的重新编程，从而在砷处理的膀胱上皮细胞中维持恶性表型。

引言

国际癌症研究机构将砷归类为1类人类致癌物，能够引发肺癌、肝癌和膀胱癌[1]。砷广泛存在于环境中，主要通过饮用水进入人体，在肝脏中代谢，然后通过肾脏排出[2]。膀胱是储存尿液的器官，膀胱上皮直接接触尿液中的砷及其甲基化代谢物。因此，膀胱是砷作用的主要靶器官之一。我们之前的研究发现，长期暴露于低浓度砷的膀胱上皮细胞的增殖和迁移能力显著增强[3]。对砷处理过的膀胱上皮细胞的蛋白质组学分析显示，NMES1的蛋白质表达水平显著增加。目前尚不清楚NMES1是否在砷诱导的增殖和迁移过程中发挥作用。

NMES1（也称为C15orf48）主要在上皮组织中表达，最初是在人类食管鳞状细胞癌中被鉴定为肿瘤抑制基因[4],[5],[6]。NMES1的表达水平和功能在不同器官中存在显著差异。研究表明，NMES1是线粒体呼吸链复合体IV（Complex IV, CIV）的一种核编码辅助蛋白[7]。RNA去甲基化酶ALKBH7（一种哺乳动物AlkB的同源物）也定位于线粒体中，并影响代谢[8]。我们的分子对接和蛋白质相互作用实验揭示了ALKBH7与NMES1之间的相互作用。作为tRNA去甲基化酶的ALKBH家族在表观遗传修饰中起着一定作用[9]，并调节RNA甲基化和表观遗传效应[10]。ALKBH3是一种tRNA去甲基化酶[11]，而ALKBH8具有DNA修复和tRNA修饰活性[12]。最近的报告指出，ALKBH7是tRNA N2,N2-二甲基鸟苷（m²₂G）的甲基化酶，m^{2₂G在前体RNA（pre-RNA）和多顺反子RNA的切割中起关键作用[13]。沉默ALKB7会通过减少tRNA m2₂G甲基化的清除，导致pre-tRNA和新生mRNA的降解，从而影响蛋白质翻译[8]。ALKB7可能会影响线粒体呼吸链亚基的表达和活性，进而影响线粒体呼吸链的功能。线粒体是为细胞提供能量的细胞器。在正常细胞中，线粒体通过氧化磷酸化生成能量以维持正常的生理功能。氧化磷酸化过程由线粒体上的五个复合体完成，每个复合体包含不同的亚基，这些亚基的合作使线粒体呼吸链能够维持正常的有氧呼吸。在各种肿瘤中观察到线粒体呼吸链复合体的中断，这增强了其他能量生成途径（如糖酵解）的补偿功能[14],[15],[16]。作为α-酮戊二酸依赖的去甲基化酶，ALKB7靶向线粒体tRNA第26位的N2-二甲基鸟苷（m2₂G）甲基化[17]。}

因此，本研究旨在探讨线粒体表观遗传修饰的改变对砷诱导的膀胱上皮细胞恶性表型的影响。我们结合体内和体外模型，研究了砷增加的NMES1表达对ALKBH7水平的影响，以及ALKBH7对线粒体呼吸链功能的影响。进一步研究了砷诱导的膀胱上皮细胞恶性表型中线粒体呼吸链异常的潜在机制，并确定了针对砷引起的膀胱上皮细胞异常增殖的干预靶点。

部分摘录

实验动物

从北京Vital River实验室动物技术有限公司购买了27只6周大的SPF级C57BL/6J雌性小鼠。小鼠被随机分为3组：对照组饮用蒸馏水，50 mg/L亚砷酸钠（NaAsO₂）暴露组和100 mg/L NaAsO₂暴露组。砷浓度的设定基于我们之前的实验研究[18]。小鼠通过饮用水暴露于NaAsO₂，持续20周。所有小鼠生活在12小时光照/12小时黑暗的环境中

砷暴露诱导小鼠膀胱上皮细胞过度增殖

在实验过程中，所有组的小鼠毛发均匀，精神状态良好，活动和饮食正常，没有死亡。所有组的小鼠体重随年龄增长而增加，各组之间的体重（图1A）或食物摄入量（图1B）没有统计学上的显著差异。与对照组小鼠相比，50 mg/L和100 mg/L亚砷酸钠组小鼠的饮水量显著减少（图1C）。

讨论

尽管无机砷是人类的致癌物，但在动物体内观察到肿瘤生长的现象较为困难[22]。在本研究中，我们观察到在暴露于砷20周的小鼠模型中，膀胱上皮细胞增厚，增殖因子PCNA、Ki67和CCND1的蛋白质表达增加。在用低浓度砷处理40周的人类膀胱上皮细胞的体外模型中，细胞表现出恶性表型，如

结论

本研究证明，砷暴露会上调NMES1的表达并抑制ALKBH7。砷诱导的NMES1增加可能抑制ALKBH7的活性，从而增加线粒体呼吸链复合体中tRNA的m²₂G甲基化修饰，并降低mt-CO2和mt-ND3亚基的表达。抑制ALKBH7会影响线粒体呼吸功能并促进糖酵解，为

作者贡献声明

李婉燕：撰写——原始草稿、方法学、数据管理、概念构思。陈泽宇：撰写——原始草稿、方法学。邓美琪：撰写——原始草稿、方法学。王世文：方法学。张磊：方法学。周青：方法学。席书华：撰写——审稿与编辑、项目管理、资金获取、概念构思

伦理声明

本研究遵循ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南进行。该研究获得了中国医科大学实验动物福利和伦理审查标准的批准（批准编号CMU20241257）。

利益冲突声明

作者声明没有可能影响本文所述工作的财务利益或个人关系。

数据可用性

数据可根据请求提供。

资助

本工作得到了国家自然科学基金（编号：82373701）的支持。

利益冲突声明

? 作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：席书华报告称获得了国家自然科学基金的财政支持。如果有其他作者，他们也声明没有已知的可能影响本文所述工作的财务利益或个人关系。

李婉燕|陈泽宇|邓美琪|王世文|张磊|周青|席书华

教育部（中国医科大学）环境压力与慢性病控制与预防重点实验室，辽宁沈阳，110122，中国