靶向神经氨酸酶的纳米抗体作为抗甲型和乙型流感病毒的治疗候选分子

《Journal of Virology》：A neuraminidase-targeting nanobody as a therapeutic candidate against influenza A and B viruses

　　

摘要
流感病毒持续对人类和动物健康构成重大威胁。然而，有限的获批抗病毒药物因高突变率导致的耐药性而日益受限。这凸显了对具有新作用机制的广谱治疗药物的迫切需求。纳米抗体作为新一代抗体药物，在治疗流感病毒感染方面具有巨大潜力。神经氨酸酶（neuraminidase，NA）介导病毒释放所需的唾液酸切割，且其基因漂移通常慢于流感病毒的血凝素（hemagglutinin，HA），使其成为广谱抗病毒药物和疫苗开发的有吸引力的靶标。为构建靶向NA的噬菌体展示纳米抗体文库，研究人员用H9N2流感病毒的NA蛋白免疫了一只羊驼。随后从免疫文库中筛选出一种特异性纳米抗体，命名为F4。该纳米抗体被工程化为Fc融合纳米抗体F4-Fc，在体外表现出针对多种甲型和乙型流感病毒的抑制活性，并在体内对甲型和乙型流感病毒感染提供稳健的预防和治疗保护。机制上，F4-Fc抑制NA酶活性并介导抗体依赖性细胞毒性（antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC）。总之，F4-Fc对甲型和乙型流感病毒具有预防和治疗效果，是一种有前景的流感病毒感染的抗病毒候选药物。
重要性
流感病毒严重威胁人类和动物健康，药物对于控制流感暴发至关重要。然而，现有抗流感病毒药物种类有限，且病毒高突变率导致耐药株不断出现。神经氨酸酶（NA）是一种关键表面糖蛋白，其抗原漂移比血凝素（HA）慢，是交叉保护性抗病毒药物开发的有吸引力的靶标。然而，具有广泛活性的靶向NA的纳米抗体，特别是对甲型和乙型流感病毒均有效的抗体，仍然有限。在此，研究人员构建了靶向多种甲型和乙型流感病毒神经氨酸酶的Fc融合F4纳米抗体（F4-Fc），并证明其在体外的抗病毒功效和体内的保护活性，突显其作为预防和治疗流感病毒感染的潜在策略。

**研究背景与问题**
流感病毒是全球严重的呼吸道病原体，每年导致约30万至60万人死亡，并感染人类、猪、蝙蝠和鸟类等多种宿主。作为一种人畜共患病，流感对公共卫生和养殖业构成双重威胁，过去一个世纪的四次流感大流行均与动物源性流感病毒相关。禽流感病毒中，H9N2亚型对家禽生产危害显著，且可作为基因供体与H7N9、H10N8、H5N2和H5N6等病毒发生基因重配，产生具有大流行潜力的新型毒株。尽管基于血凝素（hemagglutinin，HA）的疫苗在预防和控制中发挥关键作用，但HA基因的高突变率严重制约了疫苗对快速演化毒株的效果。相比之下，神经氨酸酶（neuraminidase，NA）的进化相对保守，成为开发下一代流感疫苗和抗病毒药物的理想靶标。然而，现有临床使用的抗流感药物均为化学小分子，因靶点单一和长期使用，已导致耐药或敏感性降低的毒株不断出现。抗体类药物，尤其是纳米抗体，因其小尺寸、高稳定性、深组织穿透性和易于基因工程改造等优势，被认为是应对耐药株威胁的重要方向。目前靶向NA的纳米抗体研究仍十分有限，且缺乏能同时广谱抑制不同NA亚型甲型流感病毒和乙型流感病毒的纳米抗体。因此，开发广谱NA靶向纳米抗体并阐明其抗病毒机制，是当前流感研究的关键课题。
**研究概述**
研究人员以H9N2流感病毒的NA重组蛋白免疫羊驼，构建噬菌体展示VHH文库，通过结合酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）和竞争ELISA筛选获得特异性纳米抗体F4，并将其与人IgG1 Fc段融合构建F4-Fc。体外实验系统评估了F4-Fc对多种甲型和乙型流感病毒的NA酶抑制活性、微中和活性及抗体依赖性细胞毒性（antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC）；体内实验利用小鼠致死感染模型评价了预防和治疗给药的保护效果。研究论文发表于《Journal of Virology》。
**主要技术方法**
研究人员以H9N2来源的NA重组蛋白免疫羊驼，构建噬菌体展示VHH文库；通过结合ELISA和与已知广谱人源单抗1G01的竞争ELISA筛选靶向NA的纳米抗体F4。将F4与人IgG1 Fc融合并在FreeStyle 293-F细胞中表达纯化。采用酶联凝集素测定（ELLA）和MUNANA荧光底物法检测NA抑制活性；微中和（MN）试验评估病毒抑制效力；生物层干涉术（BLI）测定亲和力及竞争结合；ADCC报告基因试验检测Fc介导的效应功能。体内保护试验使用7周龄雌性BALB/c小鼠（每组10只），经腹腔注射F4-Fc进行预防或治疗，以5×LD₅₀的A/Puerto Rico/8/1934（H1N1）、A/Hong Kong/1/1968（H3N2）和B/Guangzhou/0215/2012（Victoria）攻毒，采用病毒噬斑试验（PFA）检测肺病毒载量，并通过苏木精-伊红（H&E）染色评估肺部病理。
**研究结果**
**免疫与NA靶向H9N2纳米抗体的筛选**
通过结合ELISA从免疫文库中初步鉴定出76个N2结合克隆，经测序和CDR3分析后获得32个独特克隆；进一步以H1N1、H3N2、H5N6、H7N9、H9N2来源的NA蛋白评估交叉反应性，其中19个克隆具有交叉结合活性。竞争ELISA筛选出9个与1G01竞争N2结合的克隆，其中D1、F7和F4竞争活性最强。综合两种筛选结果，最终选择B6、D1、F4、F7、H1、H4和H10共7个纳米抗体进行后续研究。
**Fc融合纳米抗体的表征与抗病毒评估**
将7个纳米抗体分别与人IgG1 Fc融合后，ELISA证实所有构建体均保留N2结合活性。体外抗病毒实验显示，仅F4-Fc和阳性对照1G01在MDCK细胞中对H9N2病毒表现出强效抑制活性，其余6个Nb-Fc及阴性对照NC-Fc均无可检测的抗病毒作用。BLI测得F4纳米抗体与N2的亲和力K_d为6.22 nM。
**F4-Fc的交叉亚型NA抑制活性与ADCC介导的抗病毒功能**
ELLA和MUNANA试验显示F4-Fc可有效抑制N2酶活性，半数抑制浓度（IC₅₀）分别为0.05663 μg/mL和27.19 μg/mL。ADCC报告基因试验证实F4-Fc能有效诱导ADCC。BLI竞争试验确认F4可与1G01竞争结合N2，表明二者表位重叠。对多种甲型和乙型流感病毒的检测显示，F4-Fc对N1亚型（A/Puerto Rico/8/1934和A/Harbin/HL-1/2024）及B/Victoria/2/87-like谱系病毒（B/Guangzhou/0215/2012和B/Austria/1359417/2021）表现出不同程度的抑制活性，其中对B/Guangzhou/0215/2012的抑制效力优于1G01；但对A/Guangzhou/086/2022（H3N2）无可检测抑制活性，对部分N2亚型病毒的抑制效力弱于1G01。
**F4-Fc对多种流感病毒亚型的预防性保护**
在小鼠致死感染模型中，预防性给予5 mg/kg F4-Fc可显著降低肺病毒载量：与对照组相比，H1N1（A/Puerto Rico/8/1934）肺病毒载量降低约165倍，H3N2（A/Hong Kong/1/1968）降低约4倍，B/Victoria（B/Guangzhou/0215/2012）降低约1479倍。F4-Fc处理组小鼠全部存活，体重下降轻微并逐渐恢复。H&E染色显示F4-Fc有效减轻支气管周围炎、血管周围炎、肺泡炎和间质性肺炎等肺部病变。
**F4-Fc对多种流感病毒亚型的治疗性保护**
在感染后24 h给药的治疗模型中，F4-Fc对H1N1和B/Victoria/2/87-like病毒提供完全保护，对H3N2提供部分保护（5只中4只存活）。与对照组相比，肺病毒载量在H1N1模型中降低约167倍，H3N2模型中降低约7倍，B/Victoria模型中降低约50倍。存活小鼠在14天内逐渐恢复至初始体重。
**讨论与结论**
讨论部分指出，F4-Fc的Fc融合赋予其ADCC效应功能，这是NA特异性抗体发挥体内保护作用的重要机制之一。F4与1G01在N2上的表位部分重叠但不完全相同，F4对某些N1亚型病毒和B/Victoria/2/87-like病毒具有更强抑制活性，而对个别N2病毒覆盖率有限，其抗病毒活性主要取决于所识别表位在不同病毒间的保守程度，而非简单的NA亚型归属。未来可通过亲和力成熟或构建双特异性抗体（如将F4与其他广谱N2抑制抗体联合）来拓宽抗病毒谱。研究结论原文翻译如下：
总之，纳米抗体F4是从经H9N2的NA免疫的羊驼中分离得到，随后被工程化为Fc融合形式。F4-Fc在体外和体内均表现出针对多种甲型和乙型流感病毒的活性，这些发现凸显其作为季节性和人畜共患流感治疗药物的潜力，以及作为应对新发或大流行毒株的储备干预手段的价值。