《Molecular Therapy Nucleic Acids》：Next-generation macrophage engineering in cancer therapy: From TAM reprogramming to CAR-macrophages
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巨噬细胞是肿瘤微环境（TME）的核心调节者，塑造实体癌中的免疫抑制、血管生成、代谢和治疗抵抗。尽管早期策略试图耗竭肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）或阻断单核细胞募集，但有限的疗效和补偿机制揭示了功能性重编程而非消除的必要性。病毒载体、CRISPR-Cas基因组编辑
巨噬细胞是肿瘤微环境（TME）的核心调节者，塑造实体癌中的免疫抑制、血管生成、代谢和治疗抵抗。尽管早期策略试图耗竭肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）或阻断单核细胞募集，但有限的疗效和补偿机制揭示了功能性重编程而非消除的必要性。病毒载体、CRISPR-Cas基因组编辑和基于RNA的递送平台的最新进展使得巨噬细胞的精确遗传修饰成为可能，催生了嵌合抗原受体巨噬细胞（CAR-Ms）及相关工程化产品。除抗原靶向外，有效的巨噬细胞工程需要稳定促炎身份、抵抗肿瘤诱导的再极化、代谢强化以及整合检查点调节通路。本综述综合了基于DNA、mRNA和siRNA平台的当前策略，强调了连接TAM重编程与CAR-M发展的趋同设计原则。研究人员讨论了吞噬检查点的重塑、代谢和转录稳定化、细胞因子增强以及合成受体架构，强调了组合性和情境感知性工程，同时提出了新的候选基因靶点。因此，工程化巨噬细胞正从简单的效应细胞演变为可编程的免疫协调者，能够将免疫学“冷”肿瘤转化为炎症性、治疗应答的微环境。
巨噬细胞靶向策略概述
早期TAM靶向策略主要集中于通过阻断CSF1/CSF1R和CCL2/CCR2轴来耗竭巨噬细胞或抑制单核细胞募集。临床转化导致CSF1R抑制剂（包括pexidartinib和vimseltinib）获FDA批准用于腱鞘巨细胞瘤（TGCT）。然而，在大多数实体瘤中，CSF1/CSF1R和CCL2/CCR2靶向疗法作为单药疗效有限，原因是TAM耗竭不完全、抑制性巨噬细胞快速再增殖以及替代性髓系群体的补偿性募集。这些局限性将该领域转向TAM重编程策略，旨在将免疫抑制性TAMs转化为炎症性抗肿瘤效应细胞。其中，CD47-SIRPα“别吃我”轴的阻断仍是最具临床前景的巨噬细胞中心策略，但全身性CD47阻断的血液学毒性推动了肿瘤选择性和下一代SIRPα靶向方法的发展。靶向PI3Kγ通路也成为一种有前景的重编程策略。此外，Toll样受体（TLR）激动剂和CD40激动性抗体的全身性应用虽显示出免疫刺激活性，但毒性和中等疗效凸显了对更具选择性的细胞靶向巨噬细胞重编程策略的需求。
递送系统和基因修饰工具
巨噬细胞癌症免疫治疗受两个相互依赖的变量影响：治疗性巨噬细胞的细胞来源和用于其工程的遗传递送方式。离体工程仍然是最具临床先进性的策略，能够进行受控的遗传操作、功能验证和安全评估，支持复杂的多基因修饰。然而，终末分化的巨噬细胞增殖能力有限且体内持久性相对较短。原位巨噬细胞工程聚焦于直接在肿瘤内重编程内源性TAMs，基于纳米颗粒和病毒的系统利用巨噬细胞特异性启动子和TAM靶向配体实现局部递送。遗传修饰策略可分为基于DNA、mRNA和siRNA的方法。腺病毒载体有效转导非分裂巨噬细胞并已进入首次人体CAR-M试验。慢病毒载体实现稳定的基因组整合但在巨噬细胞中受SAMHD1限制。CRISPR-Cas9介导的基因组编辑允许精确敲除（KO）抑制性基因或靶向CAR敲入。基于mRNA的工程因其非整合性质、快速可制造性和与巨噬细胞生物学的兼容性而出现。基于siRNA的策略主要沉默免疫抑制通路，常与DNA或mRNA方法结合以稳定M1样极化。
巨噬细胞工程的细胞来源
细胞来源选择关键地影响转化可行性。永生化巨噬细胞系广泛用于机制研究但不适合临床使用。从外周血单核细胞（PBMCs）或骨髓来源的单核细胞/巨噬细胞（BMDMs）离体分化的原代巨噬细胞目前是主要的临床细胞来源。干细胞来源的巨噬细胞，特别是由诱导多能干细胞（iPSCs）或人胚胎干细胞（hESCs）生成的，提供了可再生和遗传可处理的替代方案。鼠巨噬细胞与人巨噬细胞之间存在实质性生物学差异，经典M1/M2极化框架在人类TAMs中很少以离散状态存在。例如，M1激活的鼠巨噬细胞通过诱导型一氧化氮合酶（iNOS/NOS2）产生大量一氧化氮（NO），而人巨噬细胞产生的NO水平显著较低。这些差异可能部分解释了靶向CSF1-CSFR1轴的治疗策略在鼠肿瘤模型中显示出强效但在实体瘤患者中临床获益有限的原因。
合成受体（CAR-M）
CAR-M概念并非复制CAR T细胞毒性，而是以抗原引导的方式重定向巨噬细胞先天功能。CAR-Ms与其它CAR平台共享模块化架构，但巨噬细胞CARs必须参与控制吞噬、炎症极化和抗原呈递的通路，通常包含基于免疫受体酪氨酸激活基序（ITAM）的胞内域如FcRγ。第一代CAR-Ms确立了可行性但揭示了关键限制：单独的CAR参与不能强制稳定的促炎巨噬细胞表型。第二代和第三代CAR-Ms将抗原识别与先天炎症信号直接偶联。第四代策略整合“装甲”巨噬细胞与表型重编程元件。潜在的第五代策略可能基于合成Notch（synNotch）受体实现可编程转录控制。
重塑吞噬作用和“别吃我”检查点
CD47-SIRPα轴代表调节巨噬细胞吞噬作用的主要抑制性检查点。为避免全身毒性，已探索巨噬细胞限制性SIRPα信号破坏。研究显示，CRISPR-Cas9介导的SIRPα敲除与肿瘤特异性CAR结合可增强吞噬作用。增强型合成吞噬受体（eSPR-CAR-M）将抗HER2 CAR与CD47阻断肽分泌相结合。原位SIRPα沉默方法也已显示有效性。CD24-Siglec通路作为额外抑制轴，双重靶向SIRPα和Siglec通路可能是实现强效巨噬细胞活化所必需的。巨噬细胞特异性RNA编辑系统（MAGE）实现了SIRPα和Siglec-10的同时体内沉默。PD-1/PD-L1轴在TAMs中也具有活性，PD-1+ TAMs表现出受损的吞噬作用和降低的促炎细胞因子产生。TAM靶向的PD-L1沉默策略已被探索用于实现局部免疫调节。
代谢重编程以稳定M1表型
PI3K/AKT/mTOR级联控制巨噬细胞的糖酵解、蛋白质合成、存活和炎症输出。选择性PI3Kγ抑制在临床前模型中促进炎症性TAM表型。在CAR-M平台内，PI3K相关信号已直接整合到受体架构中。CSF-1/CSF-1R通路对巨噬细胞存活、增殖和分化至关重要，治疗策略聚焦于瞬时抑制而非永久删除。IRG1基因（也称ACOD1）编码乌头酸脱羧酶1，负责产生免疫调节代谢物衣康酸。CRISPR-Cas9编辑的ACOD1缺陷CAR-巨噬细胞表现出增加的活性氧产生、增强的吞噬作用和稳定的M1极化。VEGF和PlGF的巨噬细胞靶向沉默提供了抗血管生成信号的局部替代方案。
转录主调控因子和先天免疫激活
STAT3的持续激活促进ARG1、IL-10、PD-L1和SIRPα的表达。STAT6是IL-4和IL-13驱动的替代性巨噬细胞激活的主要介导者。NF-κB是促炎巨噬细胞激活的主要转录驱动因子，需要精确调控其幅度和定位。在先天免疫激活方面，TLR信号是NF-κB激活和促炎细胞因子产生的生理驱动因素，其整合到CAR架构中已被用于稳定M1极化。包含TLR4 TIR域与CD3ζ串联的第二代CAR设计将抗原识别与ITAM介导的吞噬和先天炎症信号偶联。
基于细胞因子的遗传增强
基于细胞因子的遗传增强旨在通过局部扩增炎症回路来重塑TME。I型和II型干扰素代表互补策略。IL-15是NK细胞激活、CD8+ T细胞存活和持久抗肿瘤免疫建立的关键调节因子。IL-12由M1巨噬细胞产生，是Th1免疫和IFN-γ产生的强效驱动因素。共表达IL-12和CXCL9的工程化巨噬细胞驱动M2向M1再极化并增强细胞毒性T细胞和NK细胞浸润。TGF-β是实体瘤内的主要免疫抑制细胞因子，工程化巨噬细胞表达可溶性TGF-β受体II作为诱饵受体以中和肿瘤来源的TGF-β。
TAM异质性与CAR-M治疗的挑战
单细胞和空间转录组学已瓦解了TAMs作为均匀细胞类型的概念。不同肿瘤中，不同巨噬细胞生态型定位于坏死区、缺氧生态位、侵袭前沿和血管周围区室。代谢可塑性增加了另一层复杂性。早期CAR-Ms需要炎症信号来维持M1极化，后来的构建体添加了TLR4-TIR或共刺激模块并整合细胞因子“装甲”或代谢基因编辑。首次人体I期试验（CT-0508）显示CAR-Ms可定位至肿瘤并诱导T细胞浸润，但其疗效和安全性仍存在争议。目前没有单一策略能完全克服TAMs的广泛异质性，未来疗法可能结合CAR工程、瞬时核酸递送、代谢重编程和TME特异性靶向。
下一代治疗性巨噬细胞的候选靶点
下一代治疗性巨噬细胞的开发正从单通路调节转向整合性遗传编程。第一组靶点包括限制吞噬和炎症激活的抑制性受体，如LILRB家族、VISTA、TREM1/2、LAIR1、Siglec-15、MERTK、MARCO和PTPN2。第二类涉及代谢和转录重编程，如ACOD1敲除、PTPN2删除、CEBPA或KDM6B的强制表达。第三轴聚焦于先天免疫感知和共刺激，如增强STING信号或过表达4-1BB配体。下一代巨噬细胞设计日益组合化，需要多重编辑，如将检查点受体删除与代谢稳定化和炎症介质控制表达相结合，并整合逻辑门控合成系统如synNotch回路以保持空间特异性。
结论
巨噬细胞免疫治疗的轨迹反映了从试图消除TAMs到重编程和利用它们的概念转变。整合策略——结合合成受体、检查点编辑、代谢编程、细胞因子递送和先天激活模块——提供了对抗肿瘤驱动再极化的更大韧性。治疗性巨噬细胞可能演变为多重工程化、可编程系统，整合逻辑门控、诱导型表达模块和内置安全开关。其作用可能更多是TME内的催化协调者而非终端效应器。临床成功将取决于在效力和控制之间实现精确平衡、可扩展制造和稳健的安全性评估。
