体内基因组编辑ART抑制恒河猴中枢神经系统SIV储库

《Molecular Therapy Nucleic Acids》：In vivo genome editing of central nervous system SIV reservoirs in ART-suppressed rhesus macaques

　　

尽管联合抗逆转录病毒治疗（ART）可抑制人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）复制，但中枢神经系统（CNS）中的潜伏病毒储库可持续维持病毒持久性并引发神经炎症，进而促进HIV相关神经认知障碍（HAND）。AAV9递送的CRISPR已在外周组织中成功编辑SIV前病毒DNA且安全性可接受，但脑内体内基因组编辑程度仍不明确。研究人员利用SIV感染的恒河猴，绘制了CNS多区域完整前病毒DNA分布图，并测试了系统性AAV9-CRISPR-Cas9靶向Ψ包装信号与Gag区保守位点的效果。10只成年恒河猴感染遗传条形码标记SIVmac239，经ART抑制后随机接受静脉AAV9-SaCas9联合双gRNA（Ψ+Gag）或仅Cas9对照。尸检病毒反弹后，多个脑区及淋巴组织检出SIV基因组，证实ART期间CNS为持续储库。条形码分析揭示区域特异性模式，符合CNS分区持久性。CRISPR处理动物中，解剖学各异的CNS位点均可测得前病毒编辑。这些发现证明ART下灵长类脑内存在完整且潜在具复制能力病毒，系统性AAV9-CRISPR可抵达并编辑该庇护所内前病毒DNA，支持基因组编辑作为朝向CNS储库持久缓解的策略。

研究背景与问题提出

尽管强效ART能持续抑制HIV-1复制，但潜伏或低度复制病毒储库导致无法根除。CNS因免疫监视受限、血脑屏障（BBB）药物穿透差及血浆与脑脊液（CSF）病毒不一致，成为特殊挑战；HIV-1相关神经认知障碍（HAND）在有效ART下仍高发。脑内组织驻留巨噬细胞、小胶质细胞被认为是主要细胞储库，星形胶质细胞等非经典脑细胞亦可被感染。既往研究多聚焦外周CD4⁺ T细胞储库，CNS储库因BBB、细胞异质性与有限免疫监视而研究不足。SIV感染恒河猴是HIV-1治愈策略的金标准临床前模型，遗传条形码SIVmac239可追踪克隆组成。前期研究中AAV9递送CRISPR编辑外周SIV前病毒安全有效，但CNS定义脑区的编辑活性未系统评估。因此研究人员开展本研究，明确ART抑制下CNS是否为临床相关储库，并验证系统性AAV9-CRISPR-Cas9能否抵达脑内编辑Ψ与Gag保守序列。

主要关键技术方法

研究纳入10只雄性恒河猴（Macaca mulatta），静脉接种条形码SIVmac239M2，皮下ART（替诺福韦、恩曲他滨、多替拉韦）约24个月抑制后，5只慢速静脉输注AAV9-SaCas9双gRNA（Ψ_112+Gag_468，10¹³ GC/kg），5只输注无gRNA的AAV9-Cas9对照；停药1周启动分析性治疗中断（ATI），病毒反弹时尸检。体外以单拷贝整合SIV的3D8细胞与SIVmac239感染食蟹猴小胶质M1A细胞验证双gRNA RNP与AAV9载体切除活性。体内组织涵盖13个脑区、脊髓、外周神经及淋巴结、脾、肝、PBMC；检测采用微滴数字PCR（ddPCR）定量SIV Pol/Vpr、SaCas9、gRNA，完整前病毒DNA检测（IPDA）区分完整/缺陷前病毒，巢式PCR捕获Ψ-Gag切除带，Sanger与纳米孔测序分类编辑产物（clean/indel/预期缺失等），条形码高通量测序分析克隆丰富度，rhAMP-Seq评估预测脱靶位点。

研究结果

设计及CRISPR-Cas9 gRNA验证：经CRISPOR与Benchling预测选Ψ_112与Gag_468双gRNA，排除LTR gRNA以保留条形码盒。3D8细胞RNP电转产生590 bp Ψ-Gag片段切除，ddPCR显示Gag/Env信号比下降约30%切除；AAV9载体在3D8中同样确认切除。纳米孔UMI共识分析示处理样仅7.9%无编辑，预期双位点切除占18%，对照组未见预期切除。M1A小胶质细胞结果类似。

体内AAV9-CRISPR-Cas9给药：10只恒河猴按上述分组输注，ART停药1周，反弹15–34天尸检。ddPCR示SIV Pol信号淋巴结最强；SaCas9信号肝富集且广布多组织，水平高于SIV Pol；Ψ与Gag gRNA序列仅出现于5只处理动物。

SIV感染恒河猴多组织前病毒编辑：巢式PCR在处理动物淋巴结等多组织检出Ψ-Gag切除带，对照组无；肝等高SaCas9低SIV DNA组织未检出，说明编辑需CRISPR机器与底物共存。Pol区无切除，Sanger示脑切片切点连接精确。纳米孔示MD24脑47%读段为靶点切除，未处理KK68仅0.3%非预期缺失。rhAMP-Seq在49个预测脱靶位点未见显著indel增加。

各脑区SIV与Cas9分布：13脑区ddPCR示SIV Pol以前额叶皮层、脉络丛多见，Vpr以下丘脑、前额叶多见，10只动物均至少2–3脑区阳性；SaCas9逾80%脑区检出。IPDA在淋巴结、脾及前额叶、下丘脑等CNS区检出完整前病毒，但脑内完整基因组少于总Pol/Vpr信号，提示大量缺陷基因组。

CRISPR-Cas9切除神经系统SIV：处理动物19个神经组织（13脑+2脊髓+4 PNS）中部分检出约400 bp切除带，Sanger确认Ψ/Gag切点连接；编辑富集于前额叶皮层、黑质等高SIV+SaCas9区，尸检时机与编辑无显著相关。

病毒多样性条形码分析：4只动物（2对照2处理）组织测序示CNS条码丰富度高于外周（PBMC/淋巴结/脾），CNS内部多样性有限但区域特异，支持解剖分区克隆扩张与独立播种。

讨论与结论翻译

讨论指出，ART下CNS存完整且异质储库，脑内缺陷基因组为主、完整前病毒较少符合三相衰减动力学；条形码示CNS克隆区室化、独立进化。双gRNA Ψ+Gag在体内外均实现靶向切除，NHEJ/MMEJ修复产生indel与可变断点缺失，即使非完美切除也可功能失活前病毒；AAV9广布脑内但基底节、颞叶皮层编辑较多，海马较少，反映AAV9趋向性与区域摄取差异；未诱导潜伏期逆转可能限制深潜伏病毒可及性。局限性含仅雄性队列、体外条件不直接预测体内、未完全清除完整前病毒、ATI期短CSF病毒低。结论：研究证明ART抑制恒河猴脑内持久完整SIV储库存在，系统性AAV9-CRISPR-Cas9可跨BBB抵达并在多CNS区域编辑前病毒DNA，为指向CNS储库持久缓解的基因组编辑治愈策略提供大型动物模型证据，发表于《Molecular Therapy Nucleic Acids》。