《Current Plant Biology》：REVEILLE Transcription Factors as Integrators of Circadian Timing, Plant Development, and Environmental Adaptation
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REVEILLE（RVE）转录因子属于CCA1/LHY-like MYB家族，在植物谱系中保守存在，并在调控植物昼夜节律振荡器中发挥核心作用，其功能已超越时钟调控扩展到胁迫调节。本文综合了近期关于跨植物物种RVE蛋白的进化、结构架构和功能表征的研究进展。研究人
REVEILLE（RVE）转录因子属于CCA1/LHY-like MYB家族，在植物谱系中保守存在，并在调控植物昼夜节律振荡器中发挥核心作用，其功能已超越时钟调控扩展到胁迫调节。本文综合了近期关于跨植物物种RVE蛋白的进化、结构架构和功能表征的研究进展。研究人员重点阐述了RVE作为昼夜节律振荡器内关键转录激活因子、节律性染色质重塑因子以及协调昼夜基因表达的反馈环路组件的功能。研究人员讨论了RVE基因在植物中的非昼夜节律功能，包括植物生长调控、代谢协调、激素信号传导及其在响应冷、盐和热胁迫中的协同作用。此外，研究人员还探讨了大豆中RVE基因的新兴功能及其对豆科植物共生作用的潜在调控。研究人员识别出有待进一步研究的未解决争议，并提出未来研究方向以填补这些知识空白。最后，研究人员概述了一个研究路线图，并讨论了基于RVE的大豆性状改良策略的潜力。
2. RVE蛋白的进化与结构特征
2.1. RVE家族的进化
系统基因组学分析表明，CCA1/LHY/RVE是最古老的植物转录因子之一，CCL/R-R亚群估计存在于十亿多年前。CCA1/RVE分支的至少一个成员在所有植物谱系（绿藻门）中保守，从单细胞藻类到陆生植物。在地钱（Marchantia polymorpha）、角苔（Anthoceros agrestis）以及链形藻（Klebsormidium flaccidum）等植物中均发现了CCA1/LHY/RVE的同源物，表明LCL分支在维管植物谱系与苔藓植物分化之前就已建立。在小立碗藓（Physcomitrella patens）中鉴定出CCA1a和CCA1b，进一步支持了它们拥有源自CCL支架的单环时钟架构的观点。LHY/CCA1型为抑制子，而RVE8型为激活子，这种功能分化在整个植物界和一些藻类中是独特的。
2.2. 通过全基因组复制扩张及在被子植物中的多样化
对涵盖16个物种（包括苔藓、开花植物、卷柏和藻类等）的MYB相关蛋白进行全基因组调查显示，CCL/R-R亚群由LHY、CCA1和8个RVE成员组成。尽管这些亚群通过三次关键的扩张和结构域改组实现了多样化，但MYB样蛋白的DNA结合结构域仍然高度保守，表明核心结合模块的功能受到约束。被子植物拥有的LCL分支成员数量多于基部陆生植物，这与通过全基因组复制（WGD）发生的基因组扩张事件一致。假响应调节因子（PRR）与昼夜节律系统基因CCA1和RVE4之间的遗传联系在基部被子植物无油樟（Amborella）中具有共线性保守性，表明这是一种在被子植物特征中深度保守的共调控机制。在禾本科中，旁系同源物的减少破坏了这种共线性连接，且玉米群体中PRR重复基因的差异保留表明，谱系特异性的基因组重构可以将分支与其祖先调控景观分离。
2.3. 结构特征
RVE蛋白的特征在于存在一个单一的不完全myb重复序列，其结构与R2或R3 MYB基因家族相似，形成螺旋-转角-螺旋环用于识别傍晚元件（EE；AAATATCT）以及其他靶标，如靶基因启动子区域的CCA1（CBS；AAAAATCT）。EMSA和ChIP分析揭示，RVE8在主观下午特异性结合EE元件，表明MYB对DNA的识别受时间调控，而与序列特异性无关。MYB结构域在整个CCL分支中经历着强烈的纯化选择以维持结合特异性，甚至延伸至地钱转录因子和其他陆生植物，它们与被子植物共享共同的结合基序。CCL分支还包含C末端区域，称为LHY/CCA1样基序。该基序在LHY、CCA1和RVE蛋白家族成员中保守，但在R2R3-MYB成员中缺失。其在8个拟南芥RVE成员以及柱花草（Stylosanthes guianensis）的SgRVE6中均有发现，这使其区别于其他MYB成员。然而，LCL基序的确切生化作用尚未完全阐明。此外，对CCA1/LHY和RVE激活子的结构评估显示它们在转录激活活性上存在明显区别。尽管RVE8/LCL5和CCA1共享相同的EE结合结构域和早晨相表达模式，但RVE8/LCL5参与转录激活而非抑制TOC1位点。RVE8介导TOC1启动子处的组蛋白H3乙酰化以促进其激活，而CCA1则触发其去乙酰化介导的抑制。这种由相同顺式元件和时间模式介导的拮抗染色质调控，增强了靶基因波形的双向调控。
3. RVE蛋白作为植物昼夜节律钟的核心组分
3.1. 早晨环路
MYB相关的转录因子，如LATE ELONGATED HYPOCOTYL（LHY）和CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1（CCA1），是植物昼夜节律钟早晨环路的关键组分。它们的表达在黎明达到峰值，并在傍晚阶段被抑制。一些TIMING of CAB EXPRESSION 1（TOC1）和PSEUDO-RESPONSE REGULATOR（PRR）成员形成互锁的反馈回路来调控早晨环路。PRR5、PRR7和PRR9抑制CCA1/LHY，从而加强支撑振荡稳健性的反馈环路。在此背景下，RVE与CCA1/LHY共表达，但拮抗性地充当转录激活子，这有助于昼夜节律的振幅和相位精度。
3.2. RVE蛋白的转录激活
RVE蛋白是昼夜节律振荡器的关键激活子，特别是RVE4、RVE6和RVE8，它们激活傍晚相基因的表达。这些MYB相关转录因子的转录本在早晨相增加，进而促进傍晚相基因的激活。值得注意的是，RVE8表达激活TOC1和PRR5，从而增强傍晚基因的转录。RVE4和RVE6在功能上与RVE8相似，携带这些缺陷基因的突变体表现出更严重的昼夜节律紊乱。RVE通过结合傍晚元件（EE；AAAATATCT）作为转录激活子发挥作用，激活晚早晨和午后基因的表达。这种转录激活维持了振荡器内两个时相的连续性，确保早晨因子的抑制之后能及时激活下游基因。
3.3. 染色质介导的调控
RVE的功能也与染色质介导的转录调控密切相关，特别是当其与夜光相关和时钟调控蛋白结合时。例如，RVE8、LNK1和LNK2形成转录复合物以增强傍晚相时钟基因的表达。这些复合物通过靶向启动子触发转录激活。RVE8通过促进傍晚基因位点的组蛋白乙酰化来展现一致的转录活性，最终增加染色质可及性和mRNA转录本积累。LNK蛋白最近被认为可以统一昼夜节律和环境信号，尽管尚无证据明确定义它们在染色质重塑中的直接作用。与温度响应相关的调控层，包括COR27和COR28，通过直接与RVE-LNK复合物相互作用，在热诱导条件下调节昼夜节律和蛋白质稳定性，但其机制仍需进一步阐明。此外，LNK蛋白之间存在功能多样化，LNK3和LNK4已被证明在转录水平上响应冷胁迫，表明昼夜节律和外部信号在染色质重塑中发生了融合。
3.4. 反馈环路
RVE蛋白是维持昼夜节律振荡的转录反馈环路的关键组分。例如，RVE8转录激活关键的傍晚相基因PRR5和TOC1，从而促成振荡器的傍晚环路。这些被激活的傍晚基因反过来下调早晨相基因（包括CCA1和LHY）的转录本。这种负反馈间接稳定了节律性基因表达。RVE与其PPR/TOC1组分之间的关系并非通过直接的物理相互作用建模，而是在整合的环路中进行转录调控，使得转录本的表达和抑制时相能够在昼夜周期中得到协调。总之，这些复杂的调控网络将RVE定位为昼夜节律环路内基因表达时序和振幅的必要组分，将傍晚基因的表达与广泛的支持弹性和适应性昼夜节律的调控网络联系起来。
4. REVEILLE转录因子的非昼夜节律功能
4.1. 植物生长调控
RVE蛋白已被深入研究其在植物多个发育阶段（包括开花、胚轴和莲座叶）中介导器官伸长和细胞扩增的作用。下胚轴伸长是研究时钟到生长信号传导的关键模型。RVE8分支成员以光周期和碳响应的方式下调下胚轴伸长，发挥独立于其时钟功能的生长抑制作用。其关键机制归因于突变植物中光敏色素互作因子4和5（PIF4和PIF5）表达的失调。此外，CCA1/LHY和RVE4/6/8激活子独立调控莲座叶大小和下胚轴伸长，并与决定昼夜节律周期的功能存在上位性互作，表明生长和时钟的调控是同一转录网络中系统性不同的结果。RVE1也通过独立于PIF4/PIF5的通路与下胚轴伸长相关。RVE蛋白还促进温敏性下胚轴生长。RVE7蛋白和mRNA水平的升高会触发对温暖温度的响应，通过直接结合ELF4启动子的EE来抑制其表达，从而降低傍晚复合物活性并增强PIF4表达以介导温度诱导下的下胚轴伸长。RVE蛋白还调控木本植物的季节性生长周期。
4.2. 代谢协调
表型组学、蛋白质组学、转录组学和代谢组学研究表明，rve4、rve6和rve8的三重突变体普遍改变了碳水化合物代谢。沉默RVE8样蛋白会增强黎明的淀粉积累，表明正常的昼夜模式在夜间发生降解，耗尽了储备淀粉。RVE8精确结合花青素生物合成基因的启动子位点，以激活类黄酮调控网络的节律性表达。除了碳水化合物代谢，rve4 rve6 rve8的表型还表现出脂质和有机酸代谢的改变。新兴证据将光合作用响应与昼夜节律系统联系起来。RVE2可以通过冷诱导的剪接在不可翻译和可翻译的异构体之间切换，中断冷开关并改变调控基因的表达，通过上调光合作用相关基因显著增强光合作用。
4.3. 激素信号传导
RVE1通过与生长素生物合成途径相互作用，调控日间游离生长素的积累。RVE1也是关键IAA生物合成基因YUCCA8（YUC8）的正调控因子。赤霉素生物合成和种子休眠与RVE1和RVE2的调控功能相关，这些蛋白直接结合到GIBBERELLIN 3-OXIDASE 2（GA3ox2）的启动子区域以增强种子休眠。RVE8间接与RVE8分支蛋白互作以促进油菜素内酯介导的生长，并调控PIF4和PIF5的转录。
4.4. 非生物胁迫响应
4.4.1. 冷胁迫与耐冻性
RVE8和RVE4被报道直接激活DREB1基因，这是冷胁迫响应和冷冻驯化的关键调控蛋白。RVE4和RVE8在4℃下快速进行核质穿梭以介导DREB1A、DREB1B和DREB1C的转录激活。CCA1和LHY在适宜条件下同时抑制DREB1。然而，冷胁迫暴露迅速降解这两种蛋白，解除抑制效应，同时为RVE4和RVE8调控的激活创造开放的染色质构象。RVE8-LNK复合物与冷响应基因（包括CRG27和CRG28）发生复杂互作，以调控冷胁迫暴露下的转录响应。
4.4.2. 热激与耐热性
RVE4和RVE8在调控热激（HS）诱导基因表达的初始波中发挥着不依赖时钟、但具有特定日时间的作用。通过下游转录因子ETHYLENE RESPONSIVE FACTOR 53（ERF53）和ERF54，rve4/8突变体表明RVE4/8调控植物的耐热性，特别是在正午前后。
4.4.3. 温暖温度与温敏性生长
在27-28℃的温和温度下，RVE7和RVE5通过不同过程调控温敏性发育。RVE7通过EE结合抑制ELF4转录，从而削弱傍晚复合物并促进温暖环境下PIF4介导的下胚轴伸长。RVE5采用竞争衰减方法，与更强的抑制子CCA1竞争ELF4启动子上相同的EE，由于其较弱的抑制强度，其结合部分取代了CCA1，从而减少总ELF4抑制并加速高温下的生长。
4.4.4. 盐胁迫耐受性
在大豆中，属于RVE8分支的GmMYB133受盐胁迫诱导。在拟南芥中过表达GmMYB133增强了盐胁迫下的种子萌发和发育，提高了多个正调控盐胁迫基因的水平，并降低了丙二醛水平以维持胁迫下的叶绿素含量。
4.5. RVE功能的作物特异性多样化：来自大豆的见解
大豆作为异源四倍体，经历了两次连续的全基因组复制，产生了多个RVE蛋白的功能旁系同源物。大豆中鉴定出54个CCA1样（LCL）基因家族成员，其中22个蛋白被分类为LHY、CCA1和RVE成员，包括4个抑制子和18个激活子。整合GWAS和深度学习鉴定出GmRVE4d是一个调控大豆在不同光热条件下成熟的昼夜节律基因。GmRVE4d转录抑制GmPRR5a以延迟大豆开花。
4.6. RVE在结瘤时序和碳分配中的假设性作用
尽管缺乏GmRVE直接参与大豆结瘤的直接证据，但来自蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）的数据表明LHY参与了根瘤数量和功能的调控。MtLHY功能的丧失会减少根瘤形成并减弱氮同化。LHY在EE元件上的结合位点包含根瘤特异性富含半胱氨酸肽的启动子，这些启动子驱动将昼夜节律模式与共生固氮联系起来的节律性表达。
5. RVE蛋白的昼夜节律依赖性与非依赖性功能
RVE生物学中最具争议但尚未解决的问题是这些蛋白的功能主要是昼夜节律时钟的输出还是独立的转录调控因子。目前证据支持一种双功能模型，即RVE同时充当依赖于上下文的调控因子和整合环境信号与发育过程的昼夜节律振荡器。
6. 未来方向：关键研究机遇与结论
尽管大量文献评估了拟南芥中RVE介导调控的功能，但仍存在机制和转化方面的空白。例如，目前尚不清楚RVE操作的胁迫相关功能是否依赖于昼夜节律振荡器或独立调控。通过多重CRISPR基因编辑、时空ChIP-seq和多组学技术解决这些争议，将加深我们对RVE功能在作物抗逆性中作用的理解。在大豆中迫切需要进一步研究，包括利用CRISPR/Cas9介导的多重敲除或优良基因型的过表达进行功能分析，以及通过组织特异性和时间分辨的ChIP-seq鉴定直接GmRVE靶标并定义大豆调控子。一个关键未解问题是GmRVE如何时间性地协调昼夜节律周期与胁迫信号的同步化。此外，RVE在植物-微生物互作中的潜在作用仍未得到检验。利用最先进的基因组编辑工具或调控的转基因表达（如基于CRISPR的工程化）来修饰这些昼夜节律基因，以提高水分利用效率、光周期敏感性、胁迫耐受性和生殖时序，同时维持昼夜节律同步化，将有望提升大豆产量。
