综述：工程微生物菌群用于暗发酵产氢中代谢角色与电子流的协同控制

《Biomass》：Engineering Microbial Consortia for Coordinated Control of Metabolic Roles and Electron Flows in Dark-Fermentative Hydrogen Production

　　

有机废弃物的暗发酵提供了一种将分子氢(H2)生产与湿有机原料生物转化相结合的手段。然而，其实际性能仍受限于碳和电子流分布的不稳定性、底物异质性以及微生物群落结构的动态变化。本综述批判性地评估了微生物菌群工程作为提高暗发酵H2生产选择性、稳定性和可控性的策略。现有实验证据表明，H2生产率并非由单一高性能菌株决定，而是由负责水解、可溶性化合物发酵以及通过产H2途径转化的微生物协同活动所决定。这种协同作用的破坏会将碳和电子流转向乳酸、醇类、甲烷和同型产乙酸途径。合成微生物菌群能够对群落组成和代谢功能分配实现更具针对性的控制；然而，当定义明确的模型底物被化学异质性、非无菌的废弃物衍生底物所替代时，其操作性能和可重复性可能会显著下降。当群落组成与原料化学及反应器操作条件相匹配时，可获得最具可重复性的性能。进一步的进展将需要从经验性的培养物筛选转向由代谢物谱分析、分子分析以及质量和电子平衡数据支持的、针对底物特异性的微生物功能工程化。

1. 引言

论文回顾了全球能源系统对化石燃料的依赖现状，指出氢能作为低碳能源转型重要载体的作用，但强调其环境效益取决于生产方式。暗发酵因无需光照、转化速率高，在处理湿有机废弃物和本地化可再生能源生产方面具有独特优势。然而，其性能受限于Thauer极限对应的热力学上限以及培养基氧化还原电位(ORP)波动引起的质子还原反应代谢不稳定性。实际氢产量远低于理论最大值，电子被导向丁酸、丙酸、乳酸、醇类等竞争性还原产物，以及同型产乙酸途径。同时，产甲烷古菌和同型产乙酸菌对H₂的消耗构成生态威胁。合成微生物菌群(SynComs)通过分配水解、发酵、中间代谢物利用和产氢等功能，提供了更精准调控碳和电子流的框架，并可集成到生物电化学系统中实现协同能量回收。

2. 暗发酵的电子与热力学基础

该部分阐述了暗发酵中碳和电子分配的核心作用。己糖经Embden–Meyerhof–Parnas途径转化为丙酮酸，随后在梭菌型严格厌氧菌中通过丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶(PFOR)和氢酶产氢，或在肠杆菌型兼性厌氧菌中通过丙酮酸甲酸裂解酶和甲酸氢裂解酶复合体产氢。还原态铁氧还蛋白（约?400 mV）驱动质子还原在热力学上更有利，其临界H₂分压约为0.3 atm，而NADH依赖途径的临界分压极低（约6 × 10^?4 atm）。[FeFe]-氢酶，包括具有电子 bifurcation 功能的 HydABC，介导电子传递。乙酸途径理论上最高产4 mol H₂/mol己糖，丁酸途径约为2 mol，而乳酸、丙酸、乙醇等还原产物会分流电子。H₂产生后还可能被同型产乙酸菌消耗，其鉴别需结合气相组成、代谢物及功能基因（如 fthfs、hydA）分析。ORP作为反应器层面的氧化还原状态指标，与底物组成和微生物功能结构密切相关。从工程角度，H₂损失源于三种途径：电子保留在还原产物中、中间代谢物积累、以及H₂被消耗。

3. 废弃物制氢系统中微生物菌群工程原理

该部分比较了自上而下和自下而上两种菌群构建策略。自上而下工程通过对复杂接种物施加热、酸碱等选择压力，富集产氢功能群体，保留了原始微生物组的功能冗余性，但面临电子流分布可预测性差、以及隐藏生态位中同型产乙酸菌和产甲烷菌再激活的风险。自下而上工程基于明确的菌株功能互补性（如 Enterobacter aerogenes 与 Clostridium acetobutylicum 的共培养）组装合成菌群，可实现对初始组成和功能分配的精准控制，报道中最高产氢量可达5.58 mol_(H2) mol^?1_(glucose)，但其对环境稳定性要求更高。两种策略并非互斥，而是形成菌群的不同途径。自上而下方法适于探究复杂微生态的功能组织，自下而上则适于直接检验预定义的群落构成假设。此外，短期培养适合评估菌株兼容性，长期连续培养则用于评估群落稳定性。

4. 产氢状态的过程控制与优化

4.1 培养参数对过程动力学和群落选择的影响

此部分系统分析了pH、水力停留时间(HRT)、有机负荷率(OLR)、氢分压、ORP、温度、接种物与底物比(ISR)及底物投加方式对产氢性能和微生物群落功能结构的影响。pH影响发酵途径和微生物选择，其最适值依赖于水力条件（如短HRT时pH为6.0更优）。降低氢分压（如氮气吹脱、沼气循环）可显著提高产氢量。初始ORP的调控可影响产氢代谢并改变群落中 Clostridium butyricum 的相对丰度。温度和HRT-OLR组合均对产氢速率、VFAs积累及群落结构有显著影响。底物投加方式会影响乳酸作为中间代谢物或末端产物的角色。微量元素和纳米材料（如铁氧化物纳米颗粒）的作用具有剂量和微生物背景依赖性。

4.2 动力学建模与过程优化

此部分介绍了描述产氢动力学和优化操作条件的各类模型。修正的Gompertz模型广泛用于拟合批次产氢曲线，提供最大产氢潜力、最大速率和延滞期参数，但并非普遍适用，有时需采用双逻辑模型等。结构化模型（如基于厌氧消化模型No. 1 (ADM1)的模型）可整合水解、生长、VFAs生成和传质过程。响应面法(RSM)、中心复合设计(CCD)和Box–Behnken设计等实验设计方法用于识别因素间交互作用，但其计算结果依赖于特定底物-接种物组合。人工神经网络(ANN)与遗传算法(GA)等混合模型能描述复杂非线性关系，机器学习方法（如梯度提升、随机森林）和生成对抗网络(GAN)数据增强技术也被应用于预测和变量重要性解释（如SHAP分析），但模型预测需实验验证。

4.3 暗发酵的空间与时间组织

此部分讨论了微生物固定化、生物膜、膜反应器及多级反应器构型对产氢的影响。细胞固定化可将固体停留时间(SRT)与HRT解耦，实现高生物量保留和高容积产氢速率，但保留并非选择性行为，产氢菌、乳酸菌(LAB)、同型产乙酸菌和产甲烷菌均可能在附着相中存留。载体性质是独立生物过程变量，导电材料（如磁铁矿）的效应具有群落依赖性。生物膜作为扩散-反应结构，其内部微环境和功能群分布存在空间异质性。膜反应器（如动态膜生物反应器）可通过控制流体动力学调节悬浮和附着生物量并限制同型产乙酸。生物强化在颗粒形成阶段比在成熟系统中更有效。时间组织方面，通过多级系统（如两相系统）将乳酸生成与消耗阶段分离，可实现稳定的级联转化和高产氢速率，但其适用性受限于原料化学组成。

5. 菌群功能相互作用的循证验证

5.1 微生物群落的定量与空间表征

此部分强调需要结合绝对定量方法来监测群落。16S rRNA基因扩增子测序主要提供相对丰度数据，存在局限性。应采用定量聚合酶链式反应(qPCR)或多重qPCR对目标物种进行绝对定量，因为初始接种比例或相对丰度变化并不能反映菌株的实际持久性。荧光原位杂交(FISH)可提供空间分布信息。时间序列监测是必要的，因为主导产氢种群可能随运行阶段而改变。H₂消耗种群（如产甲烷古菌基于mcrA，同型产乙酸菌基于fthfs）需要单独定量监测。功能种群间的平衡比单一分类学优势更具信息量，且实验应包含独立反应器重复以确保可重复性。

5.2 种间代谢相互作用的功能分析

此部分将功能分析从基因存在扩展到基因表达和代谢活性。宏基因组学鉴定遗传潜力，而逆转录定量聚合酶链反应(RT-qPCR)、宏转录组学、蛋白质组学和酶活性测定则提供表达和催化活性的证据。hydA基因丰度或转录水平的变化需与具体产氢活性结合解释，不能单独作为产氢状态指标。对于木质纤维素底物，必须单独评估水解功能（如cel48S基因敲除对结晶纤维素水解的影响）。代谢物测量需要时间分辨率，以区分末端产物和形成后又消耗的中间体。功能解释最强时，是分子活性、代谢物转化和产气情况呈现出一致的时序响应，并结合碳和电子平衡进行验证。

5.3 因果关系的实验建立与基于平衡的评估

此部分主张通过直接的实验操作来建立因果关系。成员排除和重新引入实验比较单一共培养与纯培养对照提供更强证据。伙伴比例是定量过程变量。界面依赖型的相互作用（如 Clostridium acetobutylicum 与 Desulfovibrio vulgaris 接触依赖型物质交换）需实验证明。纤维素转化体系可分别评估水解和发酵功能。乳酸依赖型体系中，伙伴的身份和丰度决定结果。低丰度种群可能通过消耗关键中间体发挥重要功能。证据链包括：操控群落组成产生预测的变化、重新引入后功能恢复、以及碳和电子平衡验证。

6. 转化障碍与产氢微生物菌群前景

6.1 从模型底物到真实废弃物：原料异质性与功能稳定性

真实废弃物的化学组成、可及性和抑制物含量差异显著，影响菌群性能和稳定性。木质纤维素预处理产生的抑制物（如糠醛、香草醛）具有浓度和化合物特异性效应。污泥中的氨氮、污染物（如多溴联苯醚）及无机灰分均可能改变发酵过程。底物浓度和投加策略影响酸化速率和种群选择。原料异质性导致跨研究的数据对比存在归一化难题。因此，基于模型底物开发的菌群不能假设可直接应用于真实废弃物，菌群设计需反映目标原料的特定约束。

6.2 面向功能的菌群设计与过程集成

未来方向是基于功能而非经验组合设计菌群。应识别原生群落中不足的特定功能，并有针对性地引入菌株进行强化。菌群描述需具备可重复性，包括菌株身份、初始丰度、比例及组装程序。稳定的功能不一定要求不变的分类学组成。计算方法，如基因组尺度代谢模型(GEMs)，可用于预测菌株互作和预选群落成员。人工智能和机器学习方法可识别原料特性、群落组成与过程变量间的非线性关系。集成方面，暗发酵(DF)与微生物电解池(MEC)的耦合可从发酵残余物中回收额外H₂。直接MEC处理某些废水（如啤酒废水）也可行。DF-MEC系统评价应涵盖第一阶段的发酵产氢和后续阶段的额外回收。

7. 结论

暗发酵性能取决于一系列微生物功能的协调工作，而非单一高产量菌株。工程化的核心在于建立与目标底物化学特性和操作条件相匹配的微生物功能群落。这需要将功能导向的菌群设计、对相互作用机制的严格验证、基于质量平衡的性能评估，以及过程集成策略相结合，以克服底物异质性和竞争性代谢途径带来的挑战，实现稳定和可控的暗发酵产氢。