荧光报告基因分析揭示核糖核苷酸促进体内错配修复

《Nucleic Acids Research》：Fluorescent reporter assay reveals ribonucleotides promote mismatch correction in vivo

　　

研究人员开发了一种基于荧光的宿主细胞复活（HCR）分析，用于报告在位点特异性掺入的核糖核苷酸邻近处错配的校正情况。核糖核苷酸导致错配校正增强。虽然单个等位基因失活或RNaseH2敲低均不足以抑制核糖核苷酸指导的MMR，但在RNaseH2敲除细胞系中观察到，在存在嵌入核糖核苷酸的情况下错配修复出现轻微但统计学显著的受损。含有位于3′或5′方向的核糖核苷酸的报告质粒在MMR proficient细胞中得到稳健修复，但在MMR deficient细胞中修复微弱，这凸显了其作为有效MMR报告子的用途。在MMR deficient细胞中，当核糖核苷酸处于3′方向时，一致观察到显著的核糖核苷酸增强错配校正。即使在与RNaseH2敲除细胞中，核糖核苷酸的存在仍导致MMR增强，这表明其他酶可能促进核糖核苷酸指导的MMR。RNaseH2缺失不足以赋予对烷化剂替莫唑胺（temozolomide）的显著抗性，这支持这样一种模型：在哺乳动物细胞中，核糖核苷酸指导的修复事件对经典MMR通路的贡献较小。研究人员提出一种模型，其中不依赖MMR的核糖核苷酸增强错配校正，当核糖核苷酸位于5′方向时可通过核糖核苷酸切除修复（RER）进行，而当核糖核苷酸位于3′方向时则通过未知机制进行。

研究背景与立项依据

DNA错配修复（mismatch repair，MMR）是维持基因组稳定性的核心通路，其核心组件MutSα（MSH2-MSH6）、MutLα（MLH1-PMS2）、EXO1、PCNA、RFC、polδ及DNA连接酶I已在体外被详尽重构。哺乳动物细胞缺乏细菌式的甲基化链识别信号，既往研究提示新合成链上的单链断裂、冈崎片段及核糖核苷酸（ribonucleotides，复制中约每6500碱基掺入一次）均可作为链区分信号；其中核糖核苷酸经RNaseH2切割产生切口进而促进链特异性MMR的机制，仅在体外生化体系中得到支持，尚未在体内直接定量。本研究即在此背景下，由Nagel等人在《Nucleic Acids Research》发表，旨在利用荧光多重宿主细胞复活（fluorescent multiplexed host cell reactivation，FM-HCR）平台，在人源细胞中直接测定单碱基错配邻近位点特异性核糖核苷酸对错配校正的影响，并解析其与RNaseH2及核心MMR因子的依赖关系。

主要技术方法概述

研究人员采用基于pMax_mOrange与pMax_mPlum荧光蛋白表达框的FM-HCR分析，将含G:G或G:T错配、并分别在错配3′或5′侧65 nt（或60 nt、6 nt）处嵌入单个核糖核苷酸（rC）的闭环双链质粒，与参比未损伤质粒及tagBFP转染效率内参共转入细胞，24 h后流式定量荧光恢复比例以推算转录链定向修复率。细胞模型涵盖人源TK6野生型及其MSH2^?/?、MLH1^?/?、RNaseH2A^?/?克隆，U2OS经CRISPR–Cas9获得的MLH1^?/?与MSH6^?/?单克隆，以及HCT116（±3号染色体补偿）、HCT15、DU145、SKOV3、U251等NCI-60来源MMR缺陷肿瘤系，和小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）WT/RNaseH2B^+/?/RNaseH2B^?/?队列；部分实验辅以LN229中miRNA介导RNaseH2A敲低。验证手段包括Western blot确认蛋白缺失、细菌RNaseHII酶切琼脂糖电泳确认核糖核苷酸存在、Sanger测序确认错配位点，以及替莫唑胺（TMZ）剂量存活曲线评估烷化剂敏感性。

研究结果

核糖核苷酸促进单碱基错配校正

在MMR proficient的HCT116+3、TK6及小鼠MEF中，含5′或3′核糖核苷酸的G:G或G:T报告质粒修复率较无核糖核苷酸对照（mOrange_GG、mPlum_GT）显著提升且突破50%上限，与已知单链切口正对照（mOrange_nGG）相当；MMR deficient细胞中基础修复近零，证实FM-HCR主要报告MMR活性且核糖核苷酸在体内充当强链区分信号。

RNaseH2部分而非完全决定REMMC

RNaseH2B^?/? MEF及RNaseH2A^?/? TK6中5′核糖核苷酸介导的增强修复（REMMC）部分下降，但单等位基因失活（RNaseH2B^+/?）或LN229中mRNA敲低至2%仍不显著削弱REMMC，说明少量RNaseH2活性即够用，且REMMC在RNaseH2缺失背景下依然存在，暗示其他切口酶可代偿。

3′核糖核苷酸可驱动不依赖MMR的错配校正

在MSH2^?/?、MLH1^?/?、MSH6^?/?及HCT15/DU145/SKOV3等MMR缺陷背景下，mOrange_GG3R（3′核糖核苷酸）仍保留约20%转录链修复，而mOrange_GG5R（5′核糖核苷酸）在多数MMR缺陷系中趋近于无；该背景修复不能被RER解释（因链置换合成背向错配），提示存在未知3′→5′核酸酶参与的MMR非依赖通路。

烷化剂敏感性

TK6的MSH2^?/?与MLH1^?/?对TMZ耐受显著增强，而RNaseH2A^?/? TK6敏感性与野生型无异；MEF中RNaseH2B缺失也不致TMZ耐受，反而因MGMT背景影响更敏感。表明核糖核苷酸指导事件对整体MMR贡献微小，不足以改变临床相关烷化剂应答。

讨论与结论翻译

研究人员讨论指出，FM-HCR平台首次在人活细胞内直接证明核糖核苷酸可作为MMR链区分信号，且5′核糖核苷酸主要经RNaseH2切口进入经典MMR或RER（距离越近效率越高，如mPlum_GT5R* 6 nt优于60 nt），3′核糖核苷酸则暴露出一条弱效、不依赖MutS/MutL的替代校正通路。核糖核苷酸指导修复在MMR总体通量中占比低，故RNaseH2缺失不引起TMZ耐受表型。作者结论原文意译如下：研究人员提出一种模型，其中不依赖MMR的核糖核苷酸增强错配校正，当核糖核苷酸位于5′方向时通过核糖核苷酸切除修复进行，而当核糖核苷酸位于3′方向时通过未知机制进行；该FM-HCR报告系统为在生理背景下并行量化位点特异性链区分信号及MMR状态提供了新工具，可拓展至人群MMR多态性评估与肿瘤活检分型。