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摘要
背景
单细胞和单核RNA测序（scRNA-seq和snRNA-seq）已深刻改变了我们对人类骨骼肌生物学的理解，然而，由于缺乏统一的参考框架和一致的细胞类型注释，可重复性和跨研究比较仍受到限制。
方法
研究人员系统地检索了来自成人人类骨骼肌的scRN
摘要
背景
单细胞和单核RNA测序（scRNA-seq和snRNA-seq）已深刻改变了我们对人类骨骼肌生物学的理解，然而，由于缺乏统一的参考框架和一致的细胞类型注释，可重复性和跨研究比较仍受到限制。
方法
研究人员系统地检索了来自成人人类骨骼肌的scRNA-seq和snRNA-seq数据集，获取并整合了七项符合条件的研究。研究人员对多种整合策略进行了基准测试，以构建一个联合参考图谱，并生成了模态感知的标记面板。选定发现通过肌肉活检中的免疫荧光进行了验证。
结果
研究人员生成了一个整合图谱，包含来自88名健康个体的122,000个细胞和630,000个细胞核，并解析出17种主要骨骼肌细胞群，涵盖单核区室和多核肌纤维。跨模态分析确定了组织和模态感知的标记面板，并提名了既有以及先前未被识别的标记。NOVA1被发现是纤维脂肪祖细胞（fibro-adipogenic progenitors, FAPs）的选择性标记，并在转录本和蛋白质水平得到验证。聚焦于肌核，伪时间建模重建了从静止肌肉干细胞到成熟I型和II型肌纤维的分化轨迹，并揭示了谱系特异性程序，包括在I型肌纤维分化中原钙黏蛋白-γ（protocadherin-γ）基因的瞬时激活。研究人员进一步提供了一个利用参考图谱进行基于标记的细胞类型预测的交互式网页应用程序。
解释
这一整合参考图谱及配套注释工具为人类肌肉转录组学建立了标准化框架，促进了细胞类型分配的一致性，并为未来肌肉发育、衰老和疾病研究提供了基线。
资助
Else Kr?ner-Fresenius-Stiftung和德国研究基金会。
人类骨骼肌整合参考图谱研究解读
单细胞和单核RNA测序（scRNA-seq和snRNA-seq）已显著推进了对人类骨骼肌细胞异质性和信号网络的理解，然而不同研究之间缺乏统一的细胞类型分类标准和参考框架，导致结果难以重复、跨研究比较受限。在其他器官中，大规模细胞图谱已被证明是解决此类问题的有效资源，但骨骼肌因肌纤维（myofiber, MF）为多核合胞体、难以被单细胞测序完整捕获，且已有数据集在测序平台、样本处理和注释策略上存在差异，因此亟需建立专门的骨骼肌参考图谱。为此，研究人员系统整合现有公开的scRNA-seq和snRNA-seq数据，构建了人类骨骼肌综合参考图谱，旨在提供标准化的细胞类型注释框架、标记基因集和生物信息学工具。该成果发表于《eBioMedicine》。
研究人员系统检索了PubMed和Gene Expression Omnibus（GEO）数据库，最终纳入7项符合标准的成人骨骼肌研究，涵盖来自88名健康个体的约122,000个细胞和630,000个细胞核。通过比较Harmony、典型相关分析（CCA）、互惠主成分分析（RPCA）和单细胞变分推断（scVI）等整合方法，最终采用Harmony进行跨数据整合，成功解析出17种主要骨骼肌细胞群体。研究人员开发了基于标记基因的交互式在线细胞类型预测工具，并通过免疫荧光验证了新型FAP标记NOVA1。利用伪时间轨迹分析重建了肌肉干细胞（MuSC）向成熟肌纤维分化的路径，并发现I型肌纤维分化中原钙黏蛋白-γ基因的瞬时激活程序。该图谱及配套工具为人类肌肉转录组学提供了标准化基线，有助于提高跨研究可重复性。
关键技术方法方面，研究人员从已发表研究中获取原始或处理后数据，样本队列来自Rubenstein等、Micheli等、Osolkov等、Perez等、Kedlian等、Lai等以及Nelke等研究；使用CellRanger或CeleScope处理fastq文件并比对至GRCh38参考基因组，采用Seurat v5.2.1进行质量控制、归一化、聚类和差异表达分析；标记基因通过Wilcoxon秩和检验并基于特异性评分排序；伪时间推断使用Palantir算法，轨迹对齐采用Genes2Genes框架；NOVA1等候选标记通过ROC曲线和免疫荧光在健康对照和包涵体肌炎（IBM）患者活检中验证；在线注释工具基于R Shiny构建，并在独立数据集中进行外部验证。
研究结果部分，首先在“人类骨骼肌的整合图谱”中，研究人员通过系统检索和整合，最终保留122,194个细胞和630,843个细胞核，经Harmony整合和聚类获得17个细胞群；对比标准自动注释工具（CHETAH、SingleR、Azimuth）后，发现这些工具无法准确识别骨骼肌特化细胞类型，如肌干细胞和I型肌纤维，强调组织特异性参考的必要性。在“非肌源细胞类型的标记基因”中，分别对单细胞和单核数据开展无偏差异表达分析，结果发现经典标记如S100A8、RGS5/ACTA2在snRNA-seq中辨别能力下降，同时提名NOVA1作为FAP的新标记；基于该标记数据库开发的在线预测工具在独立疾病数据集中表现出良好的跨条件注释能力。在“新型FAP谱系标记的验证”中，通过ROC分析，DCN区分FAP的AUC最高（0.93），NOVA1为0.86，PDGFRA为0.77；免疫荧光显示DCN主要标记细胞外基质，PDGFRA特异性高但阳性细胞数少，而NOVA1可选择性标记单个细胞，并在外部人类和小鼠骨骼肌数据中均验证了FAP特异性；与NOVA1共表达的基因富集于剪接和翻译等通路，提示其可能参与FAP中的RNA调节。在“肌肉转录组学中的肌源谱系”中，提取肌源细胞并仅用snRNA-seq数据进一步亚聚类，获得9个细胞群，包括静止MuSC（PAX7高表达）、激活/早期分化细胞以及I型和II型MF核，并识别出神经肌肉接头（NMJ）相关MF群体；研究发现TNNT1和TNNT3分别在I型和II型谱系中持续表达，可作为连续追踪纤维类型定向的标记，而MYH基因仅标记成熟MF。在“I型和II型肌纤维的发育轨迹”中，利用Palantir构建伪时间轨迹并用Genes2Genes进行基因对齐，重建了从MuSC分化为I型或II型MF的两条路径，再现了MYH7在I型、MYH1/2在II型的动态表达；基因聚类进一步发现一组仅在I型分化早期瞬时激活的基因，完全由原钙黏蛋白γ亚家族A和B组成；在外部独立数据集中，部分PCDH基因（如PCDH7、PCDH9、PCDH17）在I型MF中显示上调，PCDH1在蛋白水平上调，但未检测到γ亚家族成员，表明该瞬时程序可能在静态分析中较难捕获。
讨论部分指出，该图谱通过联合scRNA-seq和snRNA-seq，首次实现了对所有骨骼肌细胞类型包括肌纤维及其分化中间态的综合覆盖；同时揭示了模态特异性偏差，并提供了模态感知的标记面板以
